近日，南京农业大学动物医学院杨倩教授在国际生物技术领域权威期刊《Trends in Biotechnology》在线发表了题为“Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus”的研究论文。
H9N2 亚型低致病性禽流感病毒是家禽养殖领域常态化流行的关键病原，长期持续流行带来双重疫病风险：一方面直接造成家禽生长迟缓、产蛋下降，给养殖产业带来持续性经济损耗；另一方面该毒株可作为基因供体，与其他禽流感毒株发生基因重组，催生高致病性新型变异毒株，加剧了家禽疫病防控压力。RNA 干扰技术（RNAi）依托序列特异性靶向沉默机制，可精准阻断病毒基因复制，是新一代绿色抗病毒技术的核心方向。
但该技术落地畜禽规模化应用长期存在两大核心瓶颈：一是人工合成小核酸靶标筛选周期长、成本高昂，沉默效果有限；二是裸露核酸易被体内核酸酶降解，缺少适配群体饲喂、安全高效的体内递送载体，严重制约其转化。因此，研发兼具安全性、口服便捷性、规模化量产能力的核酸递送平台，对畜禽重大疫病减抗绿色防控具有重大理论与产业价值。
针对上述技术痛点，团队以公认安全、具备肠道益生功能的枯草芽孢杆菌为底盘微生物，基因编辑构建能够稳定表达H9N2禽流感病毒来源dsRNA的工程化菌株（命名为AAD）。该菌株可作为“活体工厂”持续产生抗病毒dsRNA，并通过细菌来源胞外囊泡将其包装和递送至宿主细胞。研究发现，口服AAD后，目标dsRNA可在雏鸡肠道及多个组织中被检测到，并显著降低H9N2禽流感病毒感染后肺脏和气管中的病毒载量，减轻组织病理损伤，改善感染后体重变化。异源病毒攻毒结果表明，该策略的抗病毒效果具有序列特异性。
机制研究表明，AAD来源胞外囊泡能够被鸡源细胞摄取，将长链dsRNA递送至细胞内，并经Dicer加工形成病毒来源小干扰RNA，进一步依赖Ago2介导的RNA干扰通路抑制病毒复制。同时，该递送体系还可激活TLR3、TLR7、MDA5以及IFN-α/β等天然免疫相关通路，形成RNA干扰与干扰素反应协同抗病毒的“双重防御”效应。小RNA测序结果显示，与常规体外转染dsRNA相比，胞外囊泡递送产生了更丰富、更广泛分布的病毒来源小干扰RNA，显示出更高的递送效率和抗病毒潜力。
该研究将病毒来源siRNA靶标设计、益生菌体内表达和细菌细胞外囊泡递送技术相结合，建立了“工程化益生菌—细胞外囊泡—RNA干扰抗病毒”的动物疫病防控新策略，为H9N2禽流感绿色防控提供了新的技术路径，也为其他畜禽RNA病毒的精准干预提供了可拓展的研究思路。
南京农业大学动物医学院硕士研究生刘佳琛为论文第一作者，林建教授担任通讯作者，杨倩教授给予本研究统筹指导，课题组李昱辰和崔晓靓老师以及生科院闫新教授、交叉研究院沈宏副教授均给予了宝贵建议。该研究得到国家自然科学基金、宁夏优秀青年自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金和江苏高校优势学科建设工程等项目资助。
