中国农业大学高少培团队建立多种双子叶作物高效基因编辑系统
2026年6月30日，中国农业大学农学院高少培副教授和北京大学现代农业研究院张华伟研究员团队在知名期刊《Horticulture Research》发表（非最终校稿）了题为“Robust genome editing in multiple dicot crops via a Cas9-TREX2 fusion with intron-mediated polycistronic tRNA-sgRNA system”的研究论文。研究构建了pZHA712载体，将TREX2融合到Cas9 C端，并置于inPTG多顺反子tRNA-sgRNA表达框架中，在莴苣、番茄、大豆、油菜和甘薯等双子叶作物中验证其高效编辑能力，重点考察低评分靶点、多倍体同源基因和稳定转化场景。该 CRISPR 编辑工具解决双子作物、尤其是多倍体基因组编辑效率低、sgRNA 受限痛点，大幅降低基因功能验证与精准育种试验难度，为蔬菜、油料、块根类经济作物基因敲除育种提供高效通用平台。
研究首先整合两类增强策略：一是利用TREX2的3端到5端外切酶活性，对Cas9切割后的DNA断端进行再加工，促进NHEJ产生插入缺失；二是沿用pZHA702中的inPTG系统，提高Cas9与多个sgRNA的协同表达。新载体pZHA712以pZHA702为基础，在Cas9 C端融合TREX2，并与传统pHSE401和pZHA702作对照。验证体系覆盖二倍体莴苣、番茄、大豆，四倍体油菜和六倍体甘薯。团队还采用农杆菌介导的体内转化，在莴苣和番茄中诱导毛状根，在甘薯中再生转基因块根，从而快速评估不同载体的编辑表现。为了模拟真实育种中的困难靶点，研究在多个物种和多个内源基因中刻意选择CRISPR-P v2.0评分低于0.15的sgRNA，并对每个构建体随机检测至少30条带红色荧光的独立毛状根。结果显示，pZHA712在莴苣LsPDS、LsBIN2和LsPAR1位点表现突出，超过50%的转化根编辑效率达到80%到100%最高档；整体加权编辑效率为pZHA702的1.6倍、pHSE401的2.1倍。在番茄SlEPSPS1位点，pZHA712约为pZHA702的1.7倍；在大豆同源基因GmRR11a和GmRR11d中，pZHA712也取得最高综合效率，尤其在GmRR11d上优势明显。图1 pZHA712提升多倍体作物同源基因编辑效率在多倍体作物中，该系统也具有实用价值。四倍体油菜中，pZHA712可在BnALS位点同时提高A、C亚基因组编辑，产生更多中高效率编辑根；六倍体甘薯中，单个构建体同时靶向IbSBE1和IbSBE2，即便包含低评分靶点，pZHA712的加权平均编辑效率仍达到pZHA702的1.8倍。跨5个物种统计，pZHA712相对pZHA702提高1.2到1.8倍，相对pHSE401提高2.1到7.9倍，并常产生大于10 bp的删除。稳定转化验证进一步显示，pZHA712在莴苣LsPDS、LsBIN2和LsGGP2三个位点总体优于两个对照系统。对于LsPDS，pZHA712产生更多白化表型转化体，整体突变频率以及纯合或双等位突变比例更高；在LsBIN2和LsGGP2位点，提升幅度较小，提示靶点序列或染色质环境会影响TREX2增强效果。突变谱分析显示，pZHA712在三个靶点均提高大于10 bp大片段删除频率，并增加突变类型多样性，代表性序列可见多个目标位点的长片段缺失；对每个靶点预测5个高风险脱靶位点后，检测每个靶点20个突变系，未发现脱靶突变。研究建立了一个适用于多种双子叶作物的增强型编辑平台：inPTG系统负责多sgRNA表达，Cas9-TREX2融合蛋白则在切割后进一步处理DNA断端，使NHEJ更容易产生复杂插入缺失和大片段删除。该系统在二倍体、四倍体和六倍体作物中均显示优势，尤其适合低评分sgRNA、同源基因多拷贝编辑和育种中难以回避的复杂靶点及难改良作物材料。它的价值不只是提高平均编辑率，还在于增加纯合或双等位突变、大片段删除和突变类型多样性，从而减少后续筛选成本。虽然研究尚未单独拆分TREX2融合与inPTG系统的独立贡献，也还需扩展到更多作物和其他核酸酶，但pZHA712已经为双子叶作物功能基因组研究和精准育种提供了更高效的工具。原文链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhag264
