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贵州省农业科学院油菜研究所 :蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法测定蛋白质的干扰与消除

2026-06-26 05:40:40

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考马斯亮蓝法是蛋白质定量分析的常用方法，在 Osborne 蛋白分级提取过程中，氯化钠、氢氧化钠、乙醇等分类试剂易对检测结果产生影响，尤其高浓度乙醇会造成蛋白测定值虚高，而传统氮吹除醇法操作繁琐，同时各类试剂的干扰规律尚未得到系统梳理。本文以牛血清白蛋白为标准物质，全面考察不同浓度下三种蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法的干扰效应，分析干扰作用机理，并结合紫苏饼粕实际样品验证干扰消除方案的可行性。

研究厘清了常规使用浓度范围内氯化钠、氢氧化钠对检测基本无干扰，明确高浓度乙醇为主要干扰源并阐释其作用机制；创新性采用 5 倍稀释法简化前处理，替代流程复杂的氮吹复溶工艺，可有效消除乙醇带来的检测偏差。

蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法测定蛋白质的干扰与消除

张品¹ ,刘帮艳¹,周思璇¹,夏嘉玮²,余顺波¹,李风华¹

（1.贵州省农业科学院油菜研究所，贵阳　550018；2.贵州医科大学公共卫生与健康学院，贵阳　561113 ）

DOI：10.3969/j.issn.1008-6145.2026.03.003

摘要：研究3种常用Osborne蛋白分类试剂对考马斯亮蓝（Bradford）法测定蛋白质含量的影响。以牛血清白蛋白为标准蛋白，通过比较相对测定值的变化规律，系统评估了不同浓度的氯化钠、氢氧化钠和乙醇对Bradford法测定结果的干扰效应，并进一步探讨了消除干扰的方法。当氯化钠质量浓度为15～150 mg/mL、氢氧化钠质量浓度为2～12 mg/mL时，蛋白质相对测定值保持稳定，氯化钠和氢氧化钠对蛋白质含量的测定基本无影响。当乙醇体积分数为50%～60%时，相对测定值与真实值相近；随后在乙醇浓度梯度提升过程中，相对测定值呈现浓度依赖性增长趋势，乙醇体积分数为95%时相对测定值达到146.78%，高浓度乙醇对Bradford法测定结果有显著影响。在验证试验中，通过对上清液进行5倍稀释后再行测定，可有效解决因乙醇浓度升高导致的蛋白质表观含量异常增高及总提取率超过100%的问题。该方法可用于含醇蛋白提取液中蛋白质含量的准确测定。

关键词：考马斯亮蓝法；蛋白质含量；氯化钠；氢氧化钠；乙醇；干扰

蛋白质定量是生物化学研究、食品工业营养评价、生物制药质量控制等领域的核心技术，其准确性直接决定实验可靠性与应用价值^[1‒2]。传统凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法存在操作复杂、灵敏度低、抗干扰性差等缺陷^[3‒4]，1976年提出的考马斯亮蓝(Bradford)法凭借考马斯亮蓝G-250与蛋白质的特异性结合机制，实现了快速显色、宽检测范围、高灵敏度及强抗干扰性的优势，成为现代实验室首选方法之一^[5‒7]，但仍存在检出限偏高、线性范围较窄及基质干扰等局限^[8]。

针对Bradford法的局限，研究者从多维度开展优化研究。蒋大程、毛伍祥等^[9‒10]聚焦实验操作规范的改进，如梳理关键注意事项、优化仪器使用与试剂配制流程、采用多次测定降低误差。徐亚等^[11] 针对大豆水溶性蛋白的提取与测定，系统研究了料液比、提取温度、提取时间及振荡频率等因素对测定结果的影响，并据此确立了最佳实验条件。基于筛选出的最佳提取条件，成功测定了29种河北优质大豆的水溶性蛋白含量，并对大豆水溶性蛋白的提取与测定方法体系进行了全面评价，为大豆蛋白检测提供了标准化参考。聂昌宏等^[12]建立了基于Bradford法的乳品蛋白质检测方法，并应用该方法对常见乳品类别的总蛋白质含量与乳清蛋白含量进行对比检测。杨锐等^[13] 针对γ-环糊精中酶残留的检测，基于Bradford法建立了一种快速定量方法。这些优化研究显著提升了方法的灵敏度、稳定性与适用性，完善了Bradford法的技术体系，更拓展了其在食品、医药等领域的应用场景，为蛋白质定量提供了更高效、精准的解决方案。

在科学研究和生产实践中，分离蛋白质的方法主要有碱溶酸沉法、酶解酸沉法、离子交换法和Osborne法等^[14‒16]。在蛋白质分离研究中，Osborne分类法是基于蛋白质在不同溶剂中溶解特性的系统分离方法，通过水、盐、碱、醇四元溶剂分步提取，建立水溶、盐溶、碱溶、醇溶蛋白的4级体系^[14‒16]。该方法在分级提取过程中需测定上清液蛋白含量以评估提取效果。前期在紫苏饼粕蛋白提取中发现，随乙醇浓度升高，Bradford法测定蛋白含量异常增高，醇溶蛋白提取率甚至超过100%，存在明显误差。虽然可采用氮气吹干复溶法消除干扰^[17]，但操作繁琐。因此有必要系统研究氯化钠、氢氧化钠、乙醇等试剂对Bradford法的干扰规律及消除方法。

笔者评估了Osborne蛋白分类试剂(氯化钠、氢氧化钠、乙醇)对Bradford蛋白定量法的干扰效应，提出更快速、更简便的消除干扰方法，同时为Bradford法在复合溶剂体系中的精准应用提供了方法学优化路径。

1实验部分

2结果与讨论

2.1BSA标准工作曲线

基于Bradford法的蛋白质含量测定方法，以BSA为标准品，配制系列标准工作溶液，按照操作流程进行显色反应后，测定各浓度对应的吸光度值。以BSA标准溶液浓度(x)为横坐标，对应的吸光度值(y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准工作曲线。线性回归方程为y=2.016 6x+0.040 6，相关系数为0.99。结果表明，BSA的质量浓度在0.066 7～0.40 mg/mL的范围内与吸光度值线性关系良好，表明该标准曲线的拟合度优异，可用于后续蛋白质样品的定量计算。同时，回归方程的截距较小(0.040 6)，说明方法的空白干扰较低，进一步验证了该方法的可靠性。

2.2不同Osborne蛋白分类试剂对Bradford法的影响

Osborne蛋白分类法需使用氯化钠、氢氧化钠、乙醇等试剂构建不同提取体系，这些试剂可能作为基质成分干扰Bradford法的显色反应，进而影响蛋白质定量准确性。考察了各试剂在实际应用浓度范围内对检测结果的影响。

2.2.1氯化钠对Bradford法蛋白质含量测定的影响

氯化钠是Osborne分类中盐溶蛋白的提取试剂，考察了不同氯化钠质量浓度(15～150 mg/mL)对蛋白质定量的影响，结果如图1所示。从图1中可以看出，蛋白质相对测定值稳定在99.48%～104.49%，与真实值的偏差较小(最大偏差不超过±4.49%)。在Osborne分类的常规使用浓度(60 mg/mL)下，相对测定值为101.78%，仅比真实值偏高1.78%，处于可接受的误差范围内。结果表明，氯化钠在一定范围内不会对Bradford法的显色反应产生显著干扰，其离子强度未影响考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合效率，因此在盐溶蛋白提取体系中可直接采用Bradford法进行蛋白质定量，无需额外消除氯化钠的干扰。

图1不同氯化钠浓度蛋白质含量相对测定值Fig. 1Relative measured values of protein content under different sodium chloride concentrations

2.2.2氢氧化钠对Bradford法蛋白质含量测定的影响

在Osbourne蛋白质分级提取过程中，氢氧化钠用于碱溶蛋白的提取。为模拟实际提取体系中的碱性环境，将氢氧化钠浓度设置为2～12 mg/mL，并系统考察了该浓度范围内氢氧化钠对Bradford法测定蛋白质含量的影响，结果如图2所示。从图2中可以看出，蛋白质相对测定值为100.32%～106.10%，与真实值的偏差在±6.10%以内；同时，各组测定结果的相对标准偏差(RSD)不大于3.78%，满足定量分析对精密度的要求。Bradford法对碱性缓冲体系具有良好的耐受性，氢氧化钠在一定浓度范围内未产生显著的基质干扰，因此可直接应用于碱溶蛋白提取液的蛋白质定量检测。

图2不同氢氧化钠浓度蛋白质含量相对测定值Fig. 2Relative measured values of protein content under different concentrations of sodium hydroxide

2.2.3乙醇对Bradford法蛋白质含量测定的影响

乙醇是依据Osborne分类法提取醇溶蛋白的关键溶剂。为明确其在检测过程中的干扰程度，考察了乙醇体积分数在50%～95%范围内对Bradford法测定结果的影响，结果如图3所示。从图3中可以看出，在乙醇体积分数为50%～60%时，相对测定值与真实值基本吻合，偏差较小；当乙醇体积分数超过60%后，相对测定值开始呈现明显的增长趋势，且增长幅度随乙醇浓度升高而增大，当乙醇体积分数达到95%时，相对测定值高达146.78%，正偏差达46.78%，表明乙醇浓度与Bradford法检测结果呈显著正相关，高浓度乙醇会严重干扰蛋白质的准确定量。结合相关研究^[19‒21]，乙醇对显色反应的增强机制可解释为：(1)乙醇作为质子受体，能够促进考马斯亮蓝磺酸基团的去质子化，强化其与蛋白质中精氨酸胍基的静电吸引力；(2)乙醇可破坏蛋白质表面的水合层，增加疏水区域的暴露程度，有利于考马斯亮蓝与蛋白质疏水基团的结合；(3)乙醇分子与考马斯亮蓝G-250的苯环形成π-烷基相互作用，进一步稳定染料-蛋白质三元复合物。上述作用共同导致表观吸光度随乙醇浓度非线性增加，最终引发蛋白质定量结果的正偏差。在醇溶蛋白提取体系中，需严格控制乙醇浓度，尤其应避免使用体积分数大于85%的高浓度乙醇；若因实验需求必须使用高浓度乙醇，需采取针对性的干扰消除措施，以保障定量结果的准确性。

图3不同乙醇体积分数蛋白质含量相对测定值Fig. 3Relative measured values of protein content under different ethanol volume fractions

2.3稀释对高浓度乙醇干扰的解除效果

针对高浓度乙醇(95%体积分数)引发的定量偏差问题，采用稀释法调节体系乙醇浓度，考察其干扰解除效果，结果如图4所示。从图4中可以看出，未稀释时，95%乙醇导致蛋白质相对测定值高达146.78%，正偏差显著；经5倍稀释处理后，体系中乙醇体积分数降至19%，此时蛋白质相对测定值为100.85±6.1%(n=3)，相对偏差缩减至可接受范围(±6.1%)，与真实值的吻合度显著提升。进一步分析表明，当稀释后乙醇体积分数降至临界阈值时，乙醇对显色反应的增强作用基本消失，考马斯亮蓝与蛋白质的结合恢复正常，检测结果回归至真实水平。结果证实，稀释法能够通过降低体系乙醇浓度，有效消除高浓度乙醇对Bradford法的干扰，且操作简便、成本低廉，适合用于醇溶蛋白提取液的预处理。此外，稀释过程未对蛋白质浓度造成显著影响(稀释倍数已在定量计算中校正)，保证了结果的准确性和可靠性。

图4不稀释与稀释条件下蛋白质含量相对测定值Fig. 4Relative determination value of protein content under non-dilution and dilution conditions

2.4验证试验的结果及分析

为验证上述方法在实际样品分析中的适用性，以紫苏饼粕为研究对象，进行醇溶蛋白分类提取及定量验证实验，结果如图5所示。从图5中可以看出，未稀释的醇溶蛋白提取上清液经Bradford法检测显示，蛋白质含量随乙醇提取浓度呈剂量依赖性递增，这与高浓度乙醇的干扰规律一致，导致无法准确判断最适宜的乙醇提取浓度，且虚高的测定值使得蛋白提取得率计算结果偏离真实情况。配对t检验结果显示，稀释前后的测定值差异极显著(t=8.37，p<0.001)，进一步证实高浓度乙醇对定量结果的严重干扰。将上清液经5倍稀释后重新测定，蛋白质含量呈现先上升后下降的合理趋势：当乙醇体积分数为90%时，上清液蛋白质浓度达到最大值(0.002 8 mg/mL)，符合醇溶蛋白提取的浓度依赖性规律。同时，稀释组与氮吹组(通过氮吹去除乙醇后测定)的测定结果经t检验无统计学差异(t=1.02，p=0.341)，表明稀释后的测定值与真实值基本一致，充分验证了稀释法消除高浓度乙醇干扰的有效性。

图5不同处理时蛋白质含量相对测定值Fig. 5Relative determination value of protein content in different treatments

基于验证实验结果，进一步将该方法应用于紫苏饼粕醇溶蛋白的提取实验。结合前人研究基础^[15]与前期单因素优化结果，确定提取工艺条件为：乙醇体积分数为90%、料液比为1∶30(g/mL)、室温提取4 h，重复提取3次。在此条件下，醇溶蛋白的提取率为0.219%。该方法为紫苏饼粕醇溶蛋白的高效提取与准确定量提供了可行的技术方案。

3结论

（1）乙醇是Osborne分类中提取醇溶蛋白的常用试剂，但其在Bradford法中会产生干扰，影响定量准确性。研究表明，当乙醇体积分数大于等于70%时，会竞争结合考马斯亮蓝G-250，破坏染料-蛋白质复合物的形成，导致测定结果偏高。采用5倍稀释处理，可使乙醇浓度降至干扰阈值以下，消除大于95%的干扰，显著提升测定准确性。

（2）传统氮吹法去除乙醇干扰操作繁琐且易损失蛋白。稀释法具有快速、简便、成本低的优势，尤其适合批量样品检测。该方法适用于蛋白浓度高于定量限5倍以上的样品，兼顾灵敏度与效率。

（3）该方法为精准应用Bradford法测定蛋白质含量提供理论参考，对优化蛋白质纯化工艺(如沉淀剂选择)具有指导意义；同时，建立的稀释方法可推广至甲醇、异丙醇等其他醇类的干扰评估，拓展了研究成果的应用范围，可为食品科学、生物工程等领域的蛋白质分析工作提供一定参考。

引用本文：张品，刘帮艳，周思璇，等 . 蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法测定蛋白质的干扰与消除［J］. 化学分析计量，2026，35（3）： 19.(ZHANG Pin, LIU Bangyan, ZHOU Sixuan, et al. Interference and elimination of coomassie brilliant blue method for protein determination by protein classification reagent[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2026, 35(3): 19.)

通讯作者：张品，博士，副研究员，主要从事油料加工与副产物综合利用研究

基金信息：贵州省自然科学基金项目［黔科合基础-ZK（2023）一般185］；铜仁市科技计划项目［铜市科研（2023）73号］

中图分类号：O657.3；

文章编号：1008-6145(2026)03-0019-06

文献标识码：A

收稿日期：2025-01-12

出版日期：2026-03-20

网刊发布日期：2026-04-21

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贵州省农业科学院油菜研究所 :蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法测定蛋白质的干扰与消除

蛋白分类试剂对考马斯亮蓝法测定蛋白质的干扰与消除

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

1.2仪器工作条件

1.3实验方法