引用本文:
阳红莲, 何玉华, 朱玲, 等. 藏香猪流行性腹泻病毒的 PCR检测及毒株分型[J]. 中国猪业, 2024, 19(2): 67-73.
YANG H L, HE Y H, ZHU L, et al. Diagnostic and gene detection of epidemic diarrhea virus infection in Tibetan Scent pigs[J]. China Swine Industry, 2024, 19(2): 67-73.
摘 要：为明确四川省凉山彝族自治州某藏香猪规模化养殖场哺乳仔猪腹泻的病因，试验采集腹泻仔猪的粪便和肠道样品进行实验室病原学诊断，采用RT-PCR方法检测4种常见肠道病毒的感染情况。检测结果显示，猪流行性腹泻病病毒（PEDV）检测为阳性，猪delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪群轮状病毒3种病毒均为阴性。进一步采用RT-PCR 扩增该毒株S1基因序列并测序。结果显示，该毒株与G2型变异毒株同源性最高，与其他基因型毒株同源性相对较低，因此判定该猪场仔猪发病是由猪流行性腹泻病毒G2型变异毒株感染所致。对病猪进行紧急免疫接种、治疗、消毒等综合防控措施，控制住了疫病的蔓延和发展。总结此次猪流行性腹泻病的治疗经验，为养猪场对该疫病的治疗和防控提供借鉴。
腹泻是腹泻类疾病的典型症状，腹泻病严重影响了养猪业的发展。其中，病毒性腹泻对养殖业造成的损失最大，引起了众多科研工作者的广泛关注。可以引起猪腹泻的病毒有许多，常见的有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒)、猪delta冠状病毒等。
TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，可引起消化道传染病，为二类传染病。自1933年首次报道TGEV感染猪的病例后，许多欧洲国家相继报道了该病。近些年，TGEV在我国的流行率较低。猪传染性胃肠炎具有高度接触传染性，患病猪会出现呕吐、严重腹泻、脱水，新生仔猪则出现急性和致命性腹泻。猪最易感染TGEV，但不同年龄的猪群感染TGEV的情况不同，日龄越小的猪群越易感染TGEV，感染后的症状越严重，死亡率越高，小于2周龄的仔猪死亡率高达90%以上。
猪流行性腹泻病是一种由PEDV引起的猪传染性肠道疾病。PEDV对仔猪的致病性比成年猪更强，一般病猪表现为呕吐、腹泻、脱水、厌食和体重下降等症状。1971年，英国的一个农场首次报告了PEDV的存在。1978年，比利时首次分离出该病毒。1984年，我国首次通过血清抗原试验确认PEDV抗原的存在。在2004年初，低死亡率的PEDV并没有得到全球的关注。2010年以后，高死亡率的PEDV变异毒株出现并在全球范围内传播，对全球养猪业的影响越来越大。
猪delta冠状病毒是近几年新发现的一种肠道致病型病毒，该病毒可引起母猪和仔猪的肠道病症，主要包括呕吐、水样腹泻、脱水和食欲不振等，严重时还会导致猪只脱水性死亡，且日龄越小的仔猪对病毒的传播率越高，感染症状越严重，发病率和死亡率可达30%～40%；而成年猪只虽然发病较轻，但治愈后对其生长性能及饲料转化率等均有一定影响。根据流行病学调查结果显示，PDCoV还常与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒混合感染，更加给猪场PDCoV的防控带来了极大的困难。自从2012年Woo等首次报道了香港猪群中检出PDCoV毒株以来，随后几年在加拿大、美国、中国、韩国、越南等国家或地区也陆续检测到PDCoV毒株，这表明PDCoV已在世界范围内流行，给全球养猪业均造成了巨大的经济损失。
猪轮状病毒病是由猪轮状病毒感染引起的一种以腹泻、呕吐、厌食、脱水为临床症状的急性胃肠炎传染病。猪轮状病毒是导致世界范围内仔猪剧烈腹泻的主要病原之一，给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪轮状病毒感染具有潜伏期短、传染性强、流行范围广、发病率高等特征，常与其他细菌、病毒混合感染而使病情加重，导致患病猪群死亡率升高，严重制约了我国养猪业的健康发展。
藏香猪作为凉山彝族自治州重要的养殖品种之一，是当地人民重要的经济来源，但是饲养管理、基础设施等多种因素导致各种疫病和传染病发生率高，其中仔猪腹泻尤为严重，是制约当地养猪业发展的重要因素之一。但当地关于病毒性腹泻流行情况的调查和报道很少。2022年底，仔猪腹泻病在凉山地区多个藏香猪猪场大规模发生。为了探究仔猪腹泻的主要原因，采集猪腹泻样品后送四川农业大学动物生物技术中心检测4种常见的腹泻病毒，为该猪场流行性腹泻病诊断提供参考，为后续的治疗提供思路。
2022年11月，四川凉山彝族自治州某藏香猪养殖场初生仔猪水样腹泻、呕吐、消瘦、死亡率高。青霉素、链霉素治疗效果不明显。剖检发现仔猪小肠肠壁变薄、充气、出血，肠内有未消化乳块。采集死亡仔猪肠道组织、肠内容物和粪便，低温保存，送至四川农业大学动物生物技术中心进行实验室病原学检测。
Mastercycler PCR扩增仪购自Eppendorf公司；Gel Doc 2000凝胶图像分析系统由BIO-RAD公司生产；FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit、HiScript®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和2×Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，E.Z.N.A. Gel Extraction Kit DNA购自Omega Bio-Tek公司。
取黄豆大小腹泻病病料于1.5 mL离心管中并加1 mL生理盐水，置于冷冻型高通量组织研磨机中研磨5 min。将研磨后的混悬液置于-80℃反复冻融3次后低温12 000 rpm离心5 min。取200 μL上清液，按照DNA/RNA商品化共提取试剂盒提取DNA和RNA，进一步按照反转录试剂盒说明书制成cDNA。
根据以往参考文献，设计针对4种常见猪肠道病毒的特异性检测引物，同时针对PEDV S1基因设计1对引物。引物详细信息如表1所示。
以cDNA为模板，用表1中的引物对4种常见腹泻病病毒（PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV）进行扩增。反应体系均为20.0 μL：2×Rapid Taq Master Mix 10.0 μL、上下游引物各1.0 μL、模板1.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR扩增条件为：95℃ 3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s（35个循环）；72℃ 5 min。
反应结束后，1%凝胶电泳检测扩增结果。观察是否有预期大小的目的片段，根据目的条带进行结果判定。若为阳性，扩增其S1基因送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
以合成cDNA为模板，扩增PEDV的S1基因片段、PCR反应体系（50 μL）：2× Rapid Taq Master Mix 25.0 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA 4.0 μL、ddH2O 19.0 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。按照E.Z.N.A. Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒说明回收目的基因片段，连接至pMD18-T克隆载体，连接体系如下：pMD18-T Vector 1 μL，Insert DNA 4 μL，Solution Ⅰ 5 μL，放入16℃低温连接槽中过夜连接；全量（10 μL）加入至100 μL T1 Phage Resistant感受态细胞中，冰中放置30 min。42℃金属浴加热60～90 s后，再在冰中放置1 min。加入890 μL不含任何抗性的LB液体培养基，37℃ 180 rpm振荡培养1 h，取适量已转化的感受态细胞涂布含有Amp抗性的L-琼脂平板培养基，37℃培养箱倒置培养12～16 h，形成单个菌落。用无菌10 μL枪头挑取白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小，挑选阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行核苷酸序列测定。
以实验室保存病毒株的cDNA扩增结果为阳性对照，若检测样品出现与阳性样品大小一致的条带判定为阳性，反之为阴性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。结果表明PEDV为阳性，其他3种腹泻病病毒为阴性。
测序结果在NCBI上进行BLAST比对，发现该毒株S1基因与GenBank数据库收录的PEDV G2型变异毒株（MH053412.1）核苷酸序列同源性最高，为99.2%，由此推测该猪场暴发的PEDV毒株属于G2型。
导致猪腹泻病的原因有很多，其中病毒是发病的主要原因之一。病毒性腹泻因素对于哺乳仔猪的危害严重。随着近几年腹泻病的频繁发生，猪腹泻病的危害日益加剧，临床症状日趋复杂，防治措施得不到理想的效果，最后造成养殖者难以承受的经济损失。目前较为普遍和危害较大的猪腹泻病毒有猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒等，这4种病毒也是目前最主要的猪病毒性腹泻病原体。
藏香猪又名“琵琶猪”，被称为“喝泉水、吃山珍”长大的藏香猪已成为藏族饮食文化的重要品牌。藏香猪为低脂肪型猪种，饱和脂肪含量很低，不饱和脂肪含量较高；其皮薄、肉质鲜美丰腴、营养丰富。近年来，四川、宁夏、江西等地的藏香猪养殖迅猛发展。2022年冬季，四川凉山彝族自治州多个规模化藏香猪养殖场发生了以腹泻为主要症状的传染病，给当地的养猪业造成了严重的经济损失。使用抗生素仍无法控制疫情，推测是病毒性腹泻。病猪的样品被送到四川农业大学动物生物技术中心检测，结果显示PEDV是阳性，而PoRV，PDCoV和TGEV均为阴性。确定PEDV是引起猪腹泻病的主要病因。2010年，PEDV发生变异，毒力增强，传统的CV777株疫苗对感染仔猪无法提供完全保护。传统的流行毒株为G1型，而变异毒株为G2型。本研究中测得的PEDV属于G2型，为藏香猪猪场疫苗选择提供依据。
近几年，PEDV是造成猪腹泻甚至死亡的主要病原体，而TGEV和PoRV在腹泻猪检出率很低，甚至很多报道都未检出。付萍建立了一个基于TaqMan的qRT-PCR方法用于检测PEDV，对2020—2021年我国7个省份（四川、贵州、重庆、内蒙古、河南、江苏和广西）的250份腹泻病料进行检测，PEDV阳性率为72.8%（182/250）。王鑫文等利用PCR方法对2017—2022年收集自云南省的182份仔猪腹泻病料进行检测，结果显示样品阳性率高达61.20%。Cui等在对2015—2019年间河南和山西省仔猪腹泻病料进行PCR检测时，发现PEDV阳性率高达63.7%（86/135）。此外，这些研究都基于PEDV S1基因建立了遗传进化树，均发现G2是目前国内流行的主要基因型，与本研究中结果一致。这些结果表明PEDV在我国多个省份存在并伴随着较高的流行率，是造成仔猪腹泻的主要病原之一。
虽然藏香猪的抗病性强，但不能做到绝对无病。询问藏香猪腹泻猪场负责人，经分析，认为此次的疫苗毒株选取不合适造成免疫失败，而生物安全和保暖措施不到位可能是该猪场PED发生的主要原因。针对PED疫情，建议猪场工作人员采取以下治疗和防控措施：1）病猪隔离与仔猪护理；加强疫情监测，将检测为阳性仔猪和阴性仔猪群隔离饲养，对发病严重的仔猪进行扑杀，并进行无害化处理，对病症轻微的仔猪进行治疗，如在小料盆中添加治疗腹泻药及补液盐。2）腹泻粪便及呕吐物的消毒和清理；每天对发病猪舍及周边环境进行消毒，发病产床采样洒干粉消毒剂；发生腹泻的栋舍清洗时，严格按照防控非洲猪瘟疫情的复养流程进行彻底清洗消毒。发病舍的所有物资、员工的衣服、鞋子单独浸泡消毒、清洗。3）紧急接种；根据病毒检测结果，选择合适的疫苗株，对产房母猪加免1次腹泻灭活苗，间隔2周再免疫1次腹泻灭活苗。实施以上防治措施后，腹泻仔猪死亡率有所降低，且猪场生产成绩逐渐恢复正常。
病毒性腹泻目前仍是影响养猪业发展的重要病原。其中检出频率最高的是PEDV，应引起养猪人的重视。虽然其他腹泻性病毒如TGEV、PoRV、PDCoV等检出率低，但仍不可轻视。冬季是仔猪腹泻病的高发期，应做好猪舍的保温和生物安全防控措施。目前针对病毒性腹泻没有“特效药”，因此只能对症治疗。本次PED在凉山藏香猪场发生后，根据检测和测序结果提出一些建议。虽然治疗效果差，仍然有仔猪不断死亡，但随着一系列措施（隔离、消毒和紧急免疫）的实施，PED疫情得到了控制。此次案例也说明，疫苗免疫时选择合适的疫苗株对疫病的防控至关重要。希望本报道能为仔猪病毒性腹泻病的防控提供参考。
《中国猪业》杂志于2006年创刊，双月刊（国际标准连续出版物号：ISSN 1673-4645；国内统一连续出版物号：CN 11-5435/S）。由中华人民共和国农业农村部主管，中国农业科学院农业信息研究所主办，中国农业科学院生猪产业专家团指导，系“中国农林核心期刊”“中国核心期刊（遴选）数据库”收录期刊、“中国期刊全文数据库”收录期刊、“中文科技期刊数据库”收录期刊、中国畜牧兽医期刊精品（优秀）科技期刊，是原国家新闻出版广电总局首批认定的学术期刊。主要设置遗传繁殖、营养饲料、生物安全与疫病防控、数智化设备工艺、肉品科学、低碳养殖、猪业经济栏目。
《中国猪业》杂志投稿网站：
http://zhuye.aiijournal.com
杂志订阅：
https://mall.11185.cn/web/detailsBk?id=111291&shopId=&businessId=BK&udcSrc=BK_search
杂志邮箱：zhuye@caas.cn
垂询电话：010-82109662，15652937062，13436984376（微信同号）
地址：北京市海淀区中关村南大街12号农业信息研究所《中国猪业》编辑部
欢迎加入《中国猪业》读者交流群，群内将不定期发布相关信息，并组织开展专题研讨会、作者分享会、审稿人培训会等活动。
请在后台留言【姓名】+【工作单位（或在读学校）】，小编审核后将及时为您发送群聊二维码。
10个月宝宝每天需要喝多少奶粉？
