PBJ | 中国农业大学孙其信院士团队揭示小穗数基因WAPO1通过翻译后修饰TaFT1调控小麦穗型与产量分子机制

1. 确定WAPO-A1是调控每穗小穗数的主效基因及其关键功能变异

为挖掘调控小麦每穗小穗数的关键位点，研究者利用大穗种质AS420与栽培品种轮选987构建的重组自交系群体进行QTL定位，在染色体7AL上检测到一个主效且环境稳定的数量性状位点QSns.cau-7A（图1A）。通过侧翼标记结合关键重组单株分析，并对1395个分离后代进行筛选，最终将目标区间精细定位至225.4 kb（标记7A-3892至7A-2314），该区间内包含已报道的WAPO-A1（TraesCS7A02G481600）（图1B）（Kuzay et al., 2019; Muqaddasi et al., 2019; Voss-Fels et al., 2019）。进一步对亲本WAPO1基因的重测序数据分析揭示了两个单倍型：轮选987携带的WAPO-A1f相较于AS420携带的WAPO-A1b，除启动子区存在115 bp缺失及多个SNP外，编码区还存在一个关键的G140T变异，导致保守F-box基序内第47位氨基酸由半胱氨酸（C）突变为苯丙氨酸（F）（图1B）。尽管表达分析显示亲本及近等基因系间WAPO1转录水平无显著差异，表明启动子多态性可能不是表型分化的主要原因。利用该SNP开发的特异性标记（WAPO1-marker）分析表明，在所有田间环境型中，携带G140T（编码C47F）不同基因型的RIL株系间每穗小穗数存在极显著差异（图1C），且该变异还影响株高与穗长，表现出明显的多效性。综上所述，本研究通过图位克隆与等位基因分析，确证了WAPO1是QSns.cau-7A的候选基因，并确定了决定表型分化的关键功能性错义突变C47F。

2. WAPO1以等位基因特异性的亲和力与TaFT1发生物理互作

鉴于WAPO1蛋白F-box结构域内发生C47F氨基酸替换，研究者推测该突变可能影响其蛋白生物学功能。对小麦幼穗cDNA文库进行酵母双杂交筛选，发现WAPO1与开花因子TaFT1存在相互作用（Chen et al., 2022; Yan et al., 2006）。这一互作关系通过互补实验得到验证：双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）实验显示WAPO-A1b与TaFT1在细胞核内发生物理互作（图2A-C）。进一步分析天然C47F变异对该互作的影响发现，比较LCI和Co-IP实验证实WAPO-A1b与TaFT1的互作信号显著强于WAPO-A1f（图2D 2E），表明氨基酸C到F的变异增强了WAPO1与TaFT1的结合亲和力。为验证WAPO1是否调控TaFT1蛋白稳定性，研究者利用TaFT1-LUC作为报告系统进行检测，发现与GFP对照组相比，WAPO-A1b-GFP显著降低了TaFT1-LUC的荧光素酶活性（图2F）。这一结果在蛋白降解实验中得到进一步证实：与对照相比，共表达WAPO-A1b-GFP导致TaFT1-MYC的蛋白积累量显著下降，而添加蛋白酶体抑制剂MG132则阻断了这一降解效应（图2G）。研究者进一步检测两者在介导降解效率上的差异。降解实验显示，虽然两种等位蛋白均可促进TaFT1降解，但WAPO-A1b的活性显著更强（图2H）。LCI报告实验同样证实，相比WAPO-A1f-GFP，WAPO-A1b-GFP使

3. WAPO1介导TaFT1的泛素化修饰以促进其降解

作为F-box蛋白家族成员WAPO1能够促进TaFT1降解，研究者推测WAPO1可能作为E3连接酶介导TaFT1的泛素化修饰。免疫印迹分析显示，MBP-WAPO-A1b能够形成高分子量的泛素化产物（图3A）；随后，研究在体外体系中加入纯化的MBP-WAPO-A1b与GST-TaFT1融合蛋白，并在E1、E2、HA-Ub及ATP存在的条件下孵育。免疫印迹结果显示，仅在所有组分齐全的反应中才能检测到GST-TaFT1的强泛素化信号（图3B），在本氏烟草中也得到了相应的结果（图3C），进一步证实WAPO-A1b可在植物细胞中介导TaFT1泛素化。在此基础上，研究进一步鉴定了WAPO1介导TaFT1泛素化的关键位点。预测结合IP-MS分析，鉴定到TaFT1的第41位半胱氨酸（C41）和第44位赖氨酸（K44）为潜在泛素化位点。为验证其功能，构建了C41R、K44R单点突变及C41R和K44R双点突变的TaFT1载体。体外泛素化实验显示，与野生型GST-TaFT1相比，单点突变体的泛素化水平分别下降43%和37%，而双点突变体的泛素化水平下降最为显著，约为50%（图3D）。植物体内瞬时表达实验同样证实了该结果（图3E）。蛋白稳定性分析进一步表明，所有突变体TaFT1的蛋白积累水平均高于野生型，且双点突变体积累最高（图3F），证明C41与K44均为WAPO1介导泛素化的真实位点，并以累加效应调控TaFT1的稳定性。该结果为揭示WAPO1通过泛素-蛋白酶体途径调控TaFT1蛋白稳定性及每穗小穗数的分子机制提供了关键证据。

4. 田间条件下提高WAPO1表达可显著提升小麦产量

5. 优异等位变异WAPO-A1b在高产小麦育种中的应用潜力

为深入解析WAPO-A1b与WAPO-A1f的自然演化规律及地理分布特征，研究者基于编码区G140T关键变异开发了特异性分子标记，并利用该标记对包含28份二倍体（AA）、49份四倍体（AABB）及215份六倍体（AABBDD）小麦种质的多样性群体进行了系统性筛查（图5A）。结果显示，WAPO-A1b等位基因最早出现于二倍体AA基因组中，并随着小麦多倍化进程在四倍体和六倍体小麦中的利用率逐渐升高，暗示该等位基因在驯化与育种过程中受到了正向选择。进一步结合1568份具有明确地理来源的小麦种质分析发现，WAPO-A1b在亚洲地区来源的种质中分布频率显著更高。特别是基于268份中国微核心种质重测序数据的分析表明，WAPO-A1b是中国青藏高原春冬麦区、南方秋播春麦区及东北春麦区的主导等位基因（图5B 5C），表明该等位基因可能在长日照生态区中被优先选择利用。为评估该等位变异在育种改良中的实际效应，对339份小麦种质进行了等位基因型与穗部性状的关联分析。结果表明，携带WAPO-A1b等位基因的种质普遍具有较多的每穗小穗数和较长的穗长，证实WAPO1在六倍体小麦中功能保守，且WAPO-A1b在不同遗传背景下均能稳定地改良穗部性状。此外，田间试验对比显示，在近等基因背景下，NIL-A1b相较于NIL-A1f单穗粒重提高11%，小区产量提高4%（图5D 5E）。综上所述，WAPO-A1b不仅能够跨越多种遗传背景稳定提升产量，且在现代育种实践中具有极高的应用潜力，是小麦高产分子设计育种的重要靶标基因。

References:

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