酵母细胞壁具有一定的机械强度和柔韧性，能够调控有机物和无机物的进出，从而为细胞提供保护。细胞膜作为酵母与外界环境的屏障，在维持细胞内稳态和保证物质正常运输方面发挥着关键作用。同时，在胁迫条件下，细胞内某些代谢产物与细胞膜之间存在紧密的耦合关系。与对照组相比，TiO₂胁迫显著降低了PR106细胞壁的通透性（图3A）。当PR106生长至16 h时，TiO₂胁迫使其细胞膜流动性明显增加（图3B）。Dong Wenqi等发现，增强细胞壁通透性可以增加耻垢分枝杆菌对抗生素的敏感性。Huang等则发现，低温胁迫促进了紫球藻中不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的合成，这两类物质通过一种“举臂操作与螺栓紧固”的调控机制共同调节细胞膜流动性，帮助该藻类抵御低温胁迫。Liu Peitong等发现，维持重组酿酒酵母细胞膜的最佳流动性对于有效提高类胡萝卜素产量至关重要。

虾青素的荧光强度与其细胞内含量密切相关，虾青素含量越高，产生的荧光强度也越强。如图4所示，不同培养时间PR106细胞表现出不同的荧光强度。无论是对照组还是TiO₂胁迫组，32 h的荧光强度均高于16 h，这与虾青素作为PR106细胞次级代谢产物的合成规律相符。16 h时，TiO₂组与对照组的荧光强度无显著差异，且虾青素的荧光分布较为均匀，未集中于细胞的特定区域，表明虾青素最初是在细胞质中合成的。然而，32 h时，PR106细胞边缘出现明显且呈环状的强荧光，表明此阶段虾青素主要聚集在脂滴中。崔红利等利用共聚焦拉曼显微镜结合多变量分析研究了雨生红球藻中的类胡萝卜素分布，证实虾青素在细胞质内呈球状和点状分布。

为了直观展示TiO₂胁迫对PR106细胞形态及虾青素分布的影响，深入探究PR106高产虾青素的代谢机制，本研究采用SEM和TEM对TiO₂胁迫下PR106细胞的超微结构进行观察，结果如图5所示。无论是将PR106培养至16 h还是32 h，在对照组和TiO₂组中，均呈现出正常的短杆状酵母形态，细胞表面饱满光滑，未见细胞破裂或内容物外流的迹象。Yang Liang等通过TiO₂驯化红法夫酵母获得了高产虾青素的优良菌株，SEM分析显示其最佳菌株ALE105的细胞体积明显小于原始菌株。细胞壁和细胞膜完整性的破坏会导致细胞形态改变，显著增加细胞对渗透压变化的敏感性，最终引发细胞死亡。因此，本研究在培养PR106 16 h和32 h后，分析了TiO₂胁迫后细胞蛋白质和核酸泄漏的情况，以评估其对细胞壁和细胞膜完整性的影响。如图6A、B所示，0～32 h PR106细胞的OD_280nm和OD_260nm变化趋势稳定，且对照组与TiO₂组间无显著差异，表明TiO₂并未破坏PR106细胞的完整性，也未影响其正常生理活动。研究表明，细胞膜脂质的组成（如鞘脂和固醇）及其生物物理特性能够协同调控细胞壁的完整性。

作为细胞内产物，虾青素的最大浓度阈值受其在细胞内的定位限制。裴宇鹏等利用TEM清晰地观察到了酵母细胞核、核孔、线粒体、微体、液泡和内质网等细胞结构。通过TEM观察不同生长阶段的PR106细胞，如图7所示，16 h时PR106细胞内尚未形成脂滴（呈透明状球形），而32 h时细胞内脂滴数量明显增加。TiO₂处理组的PR106细胞中脂滴数量显著多于对照组，表明虾青素的积累与脂滴的存在密切相关。结合PR106细胞内强荧光的分布位置（图4中呈环状的绿色荧光），可推断虾青素主要储存在脂滴中。Roach等的研究也表明虾青素可与脂肪酸结合形成虾青素酯，酯化后的虾青素储存在富含三酰甘油的脂滴中。尽管对照组与TiO₂组的虾青素产量存在差异，但脂滴均分布于PR106细胞膜附近，表明虾青素的积累可能与细胞膜相关。虾青素具有强烈的疏水性共轭多烯及末端极性基团结构，能够存在于磷脂膜内部及表面。线粒体周围未见脂滴（线粒体呈圆形），说明虾青素的合成部位并非线粒体。然而，TiO₂胁迫显著增加了PR106细胞内线粒体的数量，表明虾青素合成与线粒体存在一定关联。线粒体是微生物中负责三羧酸循环和氧化磷酸化的细胞器，是细胞能量生产的“动力工厂”。虾青素的合成与积累需要大量乙酰辅酶A作为前体物质，乙酰辅酶A进入三羧酸循环并通过氧化磷酸化途径促进ATP合成。因此，TiO₂通过激活ABC转运蛋白和PTS等膜信号通路，促进PR106细胞内脂滴和线粒体数量的增加，从而推动虾青素的积累。

本研究通过代谢组学分析明确了在胁迫条件下关键代谢物及代谢通路的动态变化规律，揭示了蔗糖代谢、类固醇生物合成、ABC转运蛋白及PTS等多条代谢网络协同调控虾青素合成的复杂机制。此外，TiO₂胁迫对细胞结构具有调节作用，如降低细胞壁通透性、增强细胞膜流动性及增加脂滴和线粒体数量，促进了虾青素的积累和细胞代谢活性。本研究不仅深化了对红法夫酵母应激响应与次级代谢产物合成关系的理解，也为基于代谢机制的精准工程改造提供了理论基础，有助于推动天然虾青素绿色高效生产技术的发展。

作者简介

第一作者：

韩田田，硕士研究生，现就读于浙江海洋大学食品与药学学院，研究方向为天然产物的提取与开发。在《Food Chemistry》《食品与发酵工业》等期刊发表中英文论文7 篇，申请发明专利1 项。

通信作者：

张晶，浙江海洋大学讲师，主讲《食品化学》《食品营养与卫生》等本科生课程。2023年国家大学生创新创业训练计划项目结项合格。主持国家自然科学基金青年基金项目1 项，浙江海洋大学人才引进科研基金项目1 项，授权3 项发明专利。