1 菌株生长特性

在37 ℃条件下，分别测定了供试菌株在24 h内于MRS以及Ca-MRS液体培养基中的生长情况，结果表明：供试菌株在两种培养基中均经历了迟滞期、对数生长期和稳定期。在MRS液体培养基中，供试菌株迟滞期均较短，约2 h后即进入对数生长期，在10 h左右到达对数末期，4 个种属之间未见明显差异，各菌株进入稳定期后的OD600在1.47～1.84之间（图1A）。在Ca-MRS液体培养基中，供试菌株迟滞期相比于在MRS液体培养基中延长，大部分菌株迟滞期延长至4 h左右，而L. plantarum KLDS1.0728和L. brevis KLDS1.0210的迟滞期则延长至6 h左右，L. casei KLDS1.0338的迟滞期更是延长至8 h左右。大部分菌株在12～14 h到达对数末期，相较于MRS液体培养基中到达对数末期的时间延长了2～4 h，其中L. rhamnosus KLDS1.0725、KLDS1.0386和L. plantarum KLDS1.0628、KLDS1.0391到达对数末期的时间仍是10 h左右，可见培养基中钙离子的加入并未影响以上4 株菌生长；L. rhamnosus KLDS1.0367、L. casei KLDS1.0343、KLDS1.0381、KLDS1.0347和L. plantarum KLDS1.0702、KLDS1.0706、KLDS1.0344、KLDS1.0715、KLDS1.0704、KLDS1.0302到达对数末期的时间延长至12 h左右；L. plantarum KLDS1.0728、L. brevis KLDS1.0210和L. casei KLDS1.0338、KLDS1.0375、KLDS1.0349、KLDS1.0374到达对数末期的时间延长至14 h左右。各菌株进入稳定期后的OD600在1.41～1.80之间，稍低于相应的在MRS液体培养基中的稳定期OD600（图1B）。由此可见在Ca-MRS液体培养基中L. casei和L. brevis两个种属的生长受到较为明显的抑制作用，L. plantarum和L. rhamnosus两个种属生长所受到的抑制作用相对较小。以上结果表明，相比于MRS液体培养基，供试菌株在Ca-MRS液体培养基中的生长变缓慢。

2 菌株对钙的富集能力

按照1.3.3节所述的方法，测定了不同菌株对钙的富集能力，结果显示，菌株对钙的富集能力表现出较大差异。20 株菌的钙富集量在8.21～43.94 mg/g之间，其中L. casei KLDS1.0375的钙富集量最高，为43.94 mg/g；L. plantarum KLDS1.0344的钙富集量最低，仅为8.21 mg/g（图2）。因此选用L. casei KLDS1.0375用于后续实验。

3 富集钙菌体的结构特点

 3.1 X射线光电子能谱分析 

X射线光电子能谱是通过测量样品受X射线激发所发射光电子的结合能，以确定其元素组成，并依据谱峰强度分析元素的化学状态及其相对含量的一种有效方法。通过X射线光电子能谱仪分析了L. casei KLDS1.0375富集钙前后4 种主要元素（C、N、O、Ca）的组成及价态分布，结果如图3所示。菌体富集钙前的X射线光电子能全扫描谱图显示，在结合能为287、401 eV和532 eV处分别出现了碳（C 1s）、氮（N 1s）和氧（O 1s）的元素特征峰，并未检测到钙元素的存在，碳、氮和氧3 种元素的占比分别为82.92%、4.42%和12.66%（图3A）。菌体富集钙后的X射线光电子能全扫描谱图显示，在结合能为288、399、532 eV和348 eV处分别出现了碳（C 1s）、氮（N 1s）、氧（O 1s）和钙（Ca 2p）的元素特征峰，碳、氮、氧和钙4 种元素的占比分别为73.32%、3.74%、20.86%和2.08%（图3B）。钙元素特征峰的出现证明了菌体对钙有效富集，菌体富集钙后氧元素的占比升高，表明钙离子可能与菌体中的含氧基团发生了相互作用。

 3.2 X射线衍射分析 

对富钙菌粉的晶体状态进行X射线衍射分析，结果如图4所示，以氯化钙在X射线衍射图谱中显示出的晶体物质特有的尖锐衍射峰作为参照。未富集钙的菌粉与富集钙的菌粉均在2θ为20°附近出现1 个较强的特征衍射峰，峰形呈现出弥散状态，相较于普通菌粉，富钙菌粉的衍射峰变为平缓且强度降低，表明L. casei KLDS1.0375菌体与钙离子发生了结合而不是简单的物理混合，并未形成有序排列的晶体结构，而是非晶体状态。

 3.3 红外光谱分析

如图5所示，菌体富集钙前后的傅里叶变换红外光谱发生了明显的变化。菌体富集钙之后，谱峰强度下降，峰位置略向右移动。3 437.13 cm-1处为—NH—的对称伸缩振动所产生的吸收峰，菌体与钙发生结合后吸收峰红移到3 418.37 cm-1，说明氨基参与了钙离子的配位作用。在2 972.76 cm-1处的吸收峰为多糖中C—H的伸缩振动，与钙发生结合后红移至2 961.04 cm-1。在1 598.43 cm-1处的吸收峰为C＝O的伸缩振动，属于蛋白酰胺I带区域，与钙发生结合后吸收峰红移到1 596.09 cm-1。在1 244.29 cm-1处的吸收峰为C—N的伸缩振动，属于蛋白酰胺III带区域，与钙发生结合后吸收峰红移到1 237.26 cm-1。在1 112.96 cm-1的吸收峰对应于多糖的—OH伸缩振动，与钙发生结合后红移到1 105.92 cm-1。以上变化表明干酪乳酪杆菌KLDS1.0375表面的蛋白质和多糖主要与钙发生相互作用。

 3.4 菌体形态分析

通过扫描电子显微镜观察了普通菌体和富钙菌体的形态，普通菌体呈现短杆状，表面光滑，无明显褶皱。菌体富集钙之后，依然呈现短杆状，但观察到菌体表面变粗糙，褶皱略有增加，且有颗粒状物质附着在菌体表面（图6）。

 3.5 激光共聚焦显微镜图分析

Fluo-3AM是常用检测细胞内钙离子的荧光探针之一，进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3滞留在细胞内，结合钙离子后可产生较强的荧光。通过激光共聚焦显微镜观察了普通菌体和富钙菌体细胞内部的钙荧光强度，结果如图7所示，普通菌体只观察到少量且微弱的绿色荧光。菌体富集钙之后，细胞内部钙荧光强度提高，显示出更为密集且强烈的绿色荧光，表明钙不仅吸附于细胞表面，还被转运至细胞内部。

 3.6 热稳定性分析

差示扫描量热法是一种热分析技术，能够测定不同样品随温度变化所产生的能量差，进而反映其热稳定性情况。热稳定性分析结果如图8所示，普通菌体在温度为151.87 ℃时出现了一个明显的吸热峰，此时的热焓值为84.91 J/g。菌体富集钙之后，吸热峰温度提高，向右偏移至167.44 ℃，热焓值升高至138.62 J/g。上结果表明，菌体富集钙之后，破坏其结构需要更高的温度以及更多的能量，L. casei KLDS1.0375富集钙之后的热稳定性有所提高。

4 讨 论

乳酸菌的钙富集能力在不同种属及菌株间存在差异性。本研究测定了20 株乳酸菌的钙富集量，从种间差异角度发现，L. casei的钙富集能力在11.95～43.94 mg/g之间，总体情况优于本研究中的L. plantarum（钙富集能力在8.21～36.48 mg/g之间）以及其他2 个种属。菌株L. casei KLDS1.0375表现出最强的钙富集能力（43.94 mg/g），该数值接近石月等筛选出的富钙能力最强的菌株——L. plantarum CY1-1（45.41 mg/g）。本研究所筛选出来的菌株钙富集能力虽未达到已报道的最高水平，但仍处于已报道菌株中的前列，且差异较小（仅相差约1.47 mg/g）。然而，值得注意的是，评价一株菌的产业化应用潜力，需综合考虑其钙富集能力与生长性能。本研究获得的菌株L. casei KLDS1.0375展现出了更快的生长速率。其在Ca-MRS液体培养基中到达对数生长末期的时间为14 h，相较于上述报道菌株L. plantarum CY1-1（约16 h）缩短了近2 h。更短的发酵周期意味着更高的生产效率和更低的能耗成本，这在工业化大规模生产中具有较大优势。尽管Ca-MRS液体培养基对L. casei KLDS1.0375的生长产生了一定抑制，但该菌株仍能有效完成钙富集过程。这一现象与前人的研究结果一致，即随着培养基中钙离子浓度的增加，对微生物生长的抑制也随之增加，这可能是由于培养基成分复杂，含有多种金属离子（如K+、Mn2+、Mg2+），高浓度钙离子的存在会竞争性抑制乳酸菌与其他金属阳离子的结合，导致其生长能力下降；此外，高浓度钙离子本身也可能对菌体产生毒害或抑制作用。

乳酸菌的细胞壁是结合钙离子的主要场所，其结构和化学组成的差异直接决定了钙富集能力的高低。乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞壁以肽聚糖为核心结构单元，其分子骨架由N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸通过β-1,4-糖苷键交替连接形成线性聚合物，且通过肽桥实现高度交联。这种复杂的三维网络结构中，密集分布着羧基、氨基及羟基等官能团，这些官能团可通过配位键、氢键等作用与钙离子发生特异性结合。乳酸菌细胞壁另一标志性成分为磷壁酸，它是由核糖醇或甘油残基通过磷酸二酯键连接而成的线性多糖链，根据连接位置可分为壁磷壁酸（与肽聚糖共价结合）和膜磷壁酸（锚定于细胞膜）。磷壁酸分子中大量存在的羧基官能团，使其成为细胞壁表面负电荷的主要贡献者之一，增强了对金属阳离子的静电捕获能力。综上，钙离子可通过配位、螯合、离子交换及微沉淀等作用结合至乳酸菌细胞表面。

不同菌株合成磷壁酸的能力和数量有所不同，导致其表面负电荷密度和所带基团数量有明显差异，从而造成不同菌株间钙富集能力的巨大差别。相较于革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌的细胞壁呈现出更为复杂的层级结构。其内层为较薄的肽聚糖层，虽同样具备一定量的极性官能团，但交联度较低；外层则是由磷脂双分子层、脂蛋白、脂多糖及外膜蛋白构成的外膜结构，且该类细胞壁中不存在磷壁酸或天冬酰胺酸成分。其中，脂多糖分子的核心区域与O-特异性侧链均富含羟基、羧基及磷酸基团，磷脂分子的磷酸头部也带有负电荷，这些结构共同构成了外膜表面重要的金属离子结合位点。无论是革兰氏阳性菌的肽聚糖与磷壁酸，还是革兰氏阴性菌的肽聚糖、磷脂及脂多糖，其分子结构中均含有大量阴离子官能团，这使得细菌细胞表面带有负电荷。这种带电特性为微生物与金属阳离子之间的相互作用提供了关键的物质基础，不仅决定了细胞壁对金属离子的结合容量，还影响着其结合特异性与动力学过程，是细菌作为金属离子天然载体的核心分子机制。

另外，本研究通过扫描电子显微镜观察菌体的微观结构发现，相较于普通菌体形态，L. casei KLDS1.0375富集钙后的菌体表面变粗糙、褶皱增加且有颗粒状物质附着，这可能是由于钙与菌体表面的蛋白质和多糖发生结合后形成了生物包裹体，表面电荷发生变化，导致蛋白质和多糖的空间构象发生改变，从而出现聚集和凝结现象，此结果进一步印证了傅里叶变换红外光谱分析的结果。正是由于钙与菌体表面蛋白质和多糖发生了结合，所以在X射线衍射分析中发现富集钙的菌体为非晶体状态存在，非晶体的有机态钙更有利于人体吸收利用。此外，X射线光电子能谱分析发现菌体富集钙之后钙的相对含量增加，同样地，激光共聚焦显微镜也观察到菌体富集钙后的钙荧光强度有所提高。差示扫描量热分析发现，菌体富集钙之后吸热峰温度提高、热焓值增加，此现象归因于钙与菌体蛋白质和多糖等生物大分子结合后，交联形成了稳定的结构，使热稳定性提高，这有利于其在食品加工中的应用。

本研究成功筛选获得一株具有较高富集钙能力的乳酸菌L. casei KLDS1.0375，其来源于传统发酵乳制品，且已被列入公认安全名单，并初步解析了其富集钙后的菌体结构特点，获得了一株能递送钙的乳酸菌。就应用价值而言，富集钙的L. casei KLDS1.0375有望成为一种新型的调节骨健康的乳酸菌菌种，后续实验将进一步通过细胞以及动物实验模型研究该负载钙的乳酸菌在促进钙吸收与调节骨骼健康方面的作用与机制。

作者简介

通信作者：

孟祥晨，教授，博士生导师，食品发酵工程二级学科带头人，乳品科学教育部重点实验室乳品微生物及生物技术平台负责人。爱尔兰科克大学（UCC）访问学者，美国犹他州立大学高级访问学者。中国畜产品加工研究会常务理事，国家食品药品监督管理局食品安全专家，中国奶业协会理事，农业农村部农产品加工标准化技术委员会委员，《中国酿造》《乳业科学与技术》杂志编委；国际、国内数十种学术期刊审稿人。中国农学会青年科技奖获得者，畜产品加工研究会骆承庠基金优秀青年教师奖获得者。主要从事乳品科学与技术、食品微生物与生物技术、食品发酵等领域的教学和科研工作。先后主持、参加国家自然科学基金、教育部创新团队、“863”项目、国家科技支撑计划、省市级各类课题20余项，获各级各类奖励8 项。获授权专利10余项，转让科技成果3 项。出版专著和教材10余部，发表学术论文200余篇，其中SCI和EI收录50余篇。

第一作者：

于航，现就读于东北农业大学食品工程专业硕士研究生，研究方向为食品微生物。