ICP | 山东省农业科学院:轮作通过影响土壤微生物特性和氮循环来促进丹参的生长
长期连作对丹参（Salvia miltiorrhiza）的可持续生长构成显著威胁，而轮作作为一种可持续且高效的农业实践，能够缓解连作障碍。然而，目前关于种植制度从连作转为轮作时土壤变化的研究仍较为缺乏。本研究通过分析不同种植制度下植物生物量、土壤理化性质及微生物群落结构与功能通路，探究其响应机制。实验采集了三种种植制度（非连作SMNCC、连作SMCC、以及与烟草Nicotiana tabacum L.轮作SMCR）下丹参根际土壤样本。结果表明：连作显著降低丹参生物量，而烟草轮作则显著提升其生物量；轮作土壤的pH值和速效钾（AK）含量高于连作土壤，但碱解氮（AN）含量较低。与连作相比，烟草轮作重塑了土壤微生物群落结构，尤其影响硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和球囊菌门（Glomeromycota）等类群。冗余分析（RDA）显示环境因子是驱动细菌和真菌属分布的关键因素。氮代谢相关通路在SMCC和SMCR土壤中活性更高，但轮作导致反硝化作用相关基因（nosZ）丰度降低，可能引发田间氮素限制。此外，氨合成相关基因（hcp和cynS）及代谢相关基因（AMO、CPS1、arcC、gudB、gdhA、glnA和GLU）在SMCC与SMCR土壤中均发生显著改变。本研究为丹参可持续栽培策略提供了重要理论依据。(2) 环境因子是驱动细菌和真菌属分布的关键因素。篇名: Crop rotation increases Salvia miltiorrhiza growth by affecting soil microbial properties and nitrogen cycling期刊: Industrial Crops and ProductsDOI: 10.1016/j.indcrop.2025.122392本研究以丹参（Salvia miltiorrhiza）为研究对象，设非连作、连作及与烟草轮作三种耕作处理。于收获期采集丹参根际土壤。测定植株生物量与土壤pH、速效养分、有机质等理化指标。土壤总DNA提取后，利用Illumina MiSeq平台进行宏基因组测序分析，以揭示耕作制度转变对丹参生长和土壤生态系统的调控机制。通过测定根长与鲜重评估不同种植制度下丹参根系生物量。非连作（SMNCC）、连作（SMCC）及轮作（SMCR）系统中，丹参主根长分别为13.72 cm、9.17 cm与10.47 cm，鲜重分别为55.47 g、41.35 g与49.59 g（表1）。丹参连作（SMCC）显著降低植株生物量，而与烟草轮作（SMCR）较连作显著提升生物量。与非连作（SMNCC）相比，SMCC主根长降低33.16%，根鲜重减少25.46%；而SMCR较SMCC主根长增加14.18%，根鲜重提高19.93%。土壤pH、碱解氮（AN）、速效磷（AP）、速效钾（AK）、有机质（OM）及碳氮比（C/N）等理化性质如图1所示。与SMNCC相比，SMCC与SMCR的pH、AP及AK含量显著升高（图1a、c、d），但SMCR的pH与AK含量略高于SMCC。SMCC与SMCR的AN与OM含量显著高于SMNCC，而丹参-烟草轮作（SMCR）的AN含量较低（图1b、e）。各处理间碳氮比（C/N）无显著差异（图1f）。图1 不同种植制度下土壤理化性质。（a）pH，（b）碱解氮（AN），（c）速效磷（AP），（d）速效钾（AK），（e）有机质（OM），（f）全碳（TC）/全氮（TN）比（C/N）。字母标注表示各处理间显著性差异（单因素方差分析与Duncan检验，p < 0.05）。SMNCC：非连作；SMCC：连作；SMCR：轮作。对9个文库（SMNCC_1、SMNCC_2、SMNCC_3、SMCC_1、SMCC_2、SMCC_3、SMCR_1、SMCR_2、SMCR_3）进行宏基因组测序分析。每个文库产生超过108,703,516条原始读长（raw reads），对应16,414,230,916个碱基（raw bases）。经质量过滤后，9个样本共保留106,448,226条clean reads和16,051,975,967个clean bases，各文库中有效读长与原始读长、有效碱基与原始碱基的比例均高于97.76%和97.68%。序列组装后，每个文库包含超过984,813条contigs及518,127,535个contig bases。N50与N90值显示，超过50%的重叠群长度大于500 bp，90%以上超过332 bp。各样本中最大重叠群长度介于41,315至157,453 bp，最小为300 bp。通过样本层次聚类分析发现，相同处理的样本聚为一类，其中非连作（SMNCC）与轮作（SMCR）样本的群落组成具有高度相似性（图S1）。基于主坐标分析（PCoA），非连作（SMNCC）、连作（SMCC）及轮作（SMCR）根际土壤细菌群落分布如图2a所示。前两个主坐标轴可解释91.99%的群落变异，SMCC与SMCR的细菌群落结构相似，但均显著区别于SMNCC。图2 不同种植制度土壤细菌群落分类组成。（a）基于属水平数据的细菌群落PCoA分析；（b）韦恩图展示各样本独有及共享细菌物种；（c）门水平细菌群落组成；（d）属水平细菌群落组成（相对丰度<1%的类群合并为"Others"）。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。宏基因组测序共鉴定出13,243种细菌，其中SMNCC、SMCC与SMCR分别包含12,693、12,208和12,169种（图2b）。韦恩图显示86.73%（11,486种）为三组共有物种（图2b）。在门水平（相对丰度>1%），优势类群包括放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、未分类细菌（unclassified_d__Bacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）及硝化螺旋菌门（Nitrospirae）（图2c）。其中，未分类细菌、蓝藻门和硝化螺旋菌门在SMCC与SMCR中的相对丰度显著高于SMNCC（图2c，表S2），但SMCR中硝化螺旋菌门丰度较低。在属水平分析中，27个类群的相对丰度超过1%（图2d）。丰度最高的5个属为土壤红杆菌属（Solirubrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、康奈斯氏杆菌属（Conexibacter）和诺卡氏菌属（Nocardioides）。热图分析（图3）进一步显示，土壤红杆菌属、慢生根瘤菌属、未分类绿弯菌门（unclassified_p__Chloroflexi）、未分类细菌、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、未分类酸杆菌科（unclassified_f__Acidobacteriaceae）、候选科里杆菌属（Candidatus_Koribacter）及Pyrinomonas属等8个属在不同种植制度间存在显著差异（图3，表2）。其中，土壤红杆菌属、未分类绿弯菌门、未分类细菌、芽单胞菌属及Pyrinomonas属在SMCC与SMCR中丰度显著升高，而慢生根瘤菌属、未分类酸杆菌科和候选科里杆菌属则显著降低（图3，表2）。值得注意的是，与SMNCC相比，SMCC土壤中慢生根瘤菌属丰度大幅下降，但在烟草轮作后有所回升。图3 土壤样本中前25个细菌属相对丰度热图。颜色深浅代表各分类单元相对丰度，*标注表示P < 0.05。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。真菌群落的主坐标分析（PCoA）结果显示（图4a），前两个主坐标轴可解释80.54%的群落变异。连作（SMCC）与轮作（SMCR）样本的真菌群落结构差异较大，但二者均显著区别于非连作（SMNCC）样本。图4 不同种植制度土壤真菌群落分类组成。（a）属水平真菌群落PCoA分析；（b）韦恩图展示各样本独有及共享真菌物种；（c）门水平真菌群落组成；（d）属水平真菌群落组成（相对丰度<1%的类群合并为"Others"）。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。宏基因组测序共鉴定出473种真菌，其中SMNCC、SMCC与SMCR分别包含452、399和392种（图4b）。韦恩图显示75.90%（359种）为三组共有物种（图4b）。门水平优势类群（相对丰度>1%）包括子囊菌门（Ascomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分类真菌（unclassified_k__Fungi）、壶菌门（Chytridiomycota）及芽枝霉门（Blastocladiomycota）（图4c）。子囊菌门与球囊菌门在SMCC和SMCR间存在显著差异：子囊菌门在SMCC中丰度最高（60.75%），显著高于SMNCC（40.34%），而SMCR中降至55.66%；球囊菌门则从SMNCC的35.76%骤降至SMCC的4.55%，在SMCR中部分恢复至10.48%。在属水平分析中，29个类群的相对丰度超过1%（图4d）。热图分析（图5）显示，根孢囊霉属（Rhizophagus）、假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）、节水霉属（Gonapodya）、线虫草属（Ophiocordyceps）、木霉属（Trichoderma）、炭疽菌属（Colletotrichum）和外瓶霉属（Exophiala）等7个属在不同处理间差异显著（图5，表3）。其中根孢囊霉属在SMCC与SMCR中的丰度显著低于SMNCC；假裸囊菌属、节水霉属、线虫草属、木霉属和炭疽菌属在SMCC中丰度较高，但烟草轮作后假裸囊菌属与木霉属丰度降低；外瓶霉属仅在SMCR中显著富集（图5，表3）。图5 土壤样本中前25个真菌属相对丰度热图。颜色深浅代表各分类单元相对丰度，*标注表示P < 0.05。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。通过冗余分析（RDA）探究不同种植制度下显著变化的微生物属与环境因子的关联（图6）。结果表明：土壤pH、速效磷（AP）和速效钾（AK）主要影响SMNCC群落，而碱解氮（AN）、有机质（OM）和碳氮比（C/N）对SMCC与SMCR群落影响更大。细菌属水平的RDA模型可解释90.88%的变异（图6a）。土壤红杆菌属（Solirubrobacter）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、未分类细菌（unclassified_d__Bacteria）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、未分类酸杆菌科（unclassified_f__Acidobacteriaceae）及候选科里杆菌属（Candidatus_Koribacter）与pH、AP和AK呈正相关；而未分类绿弯菌门（unclassified_p__Chloroflexi）和Pyrinomonas属与AN、OM和C/N正相关。真菌属水平的RDA前两轴可解释99.36%的变异（图6b）。所有7个显著变化的真菌属均与pH、AP和AK呈正相关，而与AN、OM和C/N呈负相关。图6 微生物群落冗余分析。（a）细菌属RDA分析；（b）真菌属RDA分析。红色实线箭头表示环境因子，黑色实线表示微生物属。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。基于KEGG数据库对非冗余基因进行功能注释，所有土壤样本共检测到514条KEGG三级通路，其中390条（94.20%）为各处理共有（图S2）。对前40条通路的热图分析（图7a）显示，与SMNCC相比，SMCC和SMCR中嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism）、乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、丙酸代谢（Propanoate metabolism）、核糖体（Ribosome）及氮代谢（Nitrogen metabolism）相关基因显著富集（图7b，表S4）。此外，脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）、降解（degradation）与生物合成（biosynthesis）相关基因在SMCC中相对丰度下降，而SMCR中脂肪酸代谢基因丰度略高于SMCC（图7b，表S4）。图7 KEGG三级通路分析。（a）前40条富集通路的热图；（b）KEGG三级通路多重比较。热图中颜色深浅对应各分类单元相对丰度，*表示P < 0.05。SMNCC：非连作土壤；SMCC：连作；SMCR：轮作。通过KEGG注释的宏基因组数据揭示了氮循环相关基因的分布特征（图8）。同化型硝酸盐还原酶基因（narG）和硝基烷单加氧酶基因（ncd2）在SMNCC中丰度较高。而异化硝酸盐还原相关基因（nrfA、nirB）在SMCC与SMCR中丰度显著上升，其中nrfA基因在烟草轮作后丰度降低。反硝化作用相关基因（norB）在连作后富集，而SMCR土壤中nosZ基因丰度显著下降。氨合成相关基因（hcp、cynS）在SMNCC中丰度低于SMCC，但cynS在SMCR中整体丰度较高。氨代谢相关基因（AMO、CPS1、arcC、gudB、gdhA、glnA、GLU）在SMCC与SMCR中丰度上升，仅GLT1在SMNCC中更富集。甲酰胺酶基因（Fase）在SMCC和SMCR中丰度较高。图8 氮循环通路及差异基因丰度示意图。*表示P < 0.05，表示**P < 0.01，***表示P < 0.001。G1：非连作土壤（SMNCC）；G2：连作（SMCC）；G3：轮作（SMCR）。本研究通过分析不同种植制度对土壤理化性质、微生物群落多样性及功能通路的影响，发现丹参-烟草轮作可通过重塑土壤微生物群落结构并构建最优微生态环境，显著提升丹参根系生物量。在氮代谢方面，反硝化作用相关基因（nosZ）丰度的降低表明烟草轮作可抑制反硝化过程；而该过程导致的氨积累则通过氨合成基因（hcp、cynS等）的下调与代谢基因（AMO、glnA等）的上调实现动态平衡。未来研究将深入解析土壤微生物功能机制，以开发更具经济性与可持续性的轮作体系。
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