Agr, Eco | 中国农业科学院:通过使用绿肥进行可持续的钾肥管理,可以改变微生物的氮循环机制,从而提高马铃薯的产量
长期集约化马铃薯种植会导致土壤钾耗竭与氮素失衡，但钾素管理调控氮循环的微生物机制尚不明确。通过为期十年的田间试验结合宏基因组分析，本研究揭示了梯度钾肥施用（K0、K90、K180、K360）与绿肥还田（M90、K90M90）如何通过微生物功能网络调控土壤氮代谢。钾肥施用通过改变氮代谢基因谱诱导微生物功能冗余，具体表现为：钾添加显著降低硝化作用基因（amoA/B/C、hao）与反硝化基因（nirK/S、norB、nosZ），同时促进同化硝酸盐还原（nasA/B）与异化硝酸盐还原基因（nirB/D、narG/H/I）表达。这种双重调控抑制了硝化与反硝化过程，通过双还原途径减少气态氮损失并延长硝态氮有效性。肥料响应类群（如诺卡氏菌科Nocardioidaceae和克里布所氏菌科Kribbellaceae）的丰度动态与速效钾（AK）、矿物结合有机碳（MAOC）及有机氮（MAON）显著关联，协同提升马铃薯产量。钾肥-绿肥联用策略通过重塑微生物功能群落，提高钾生物有效性与固氮能力。本研究表明，优化钾素管理可通过驱动微生物组介导的氮保存机制，实现作物增产（62–119%）与农业生态系统可持续性的协同提升。该研究为集约化种植系统中基于靶向微生物调控的钾素/养分管理策略提供了机制性见解。(1) 钾肥-绿肥联用通过抑制硝化与反硝化基因、同时激活硝酸盐双重还原途径（同化与异化），实现对氮循环过程的定向调控。(2) 土壤速效钾（AK）与矿物结合有机氮（MAON）驱动了钾梯度下与产量关联的关键微生物类群（如诺卡氏菌科）的演替。(3) 钾肥施用通过氮循环功能类群的生态位分化，促进微生物群落功能冗余的形成。篇名: Sustainable potassium management with green manure reshapes microbial nitrogen cycling to enhance potato yield期刊: Agriculture, Ecosystems & EnvironmentDOI: 10.1016/j.agee.2025.110124本研究采用随机区组设计，设6个处理：K0（不施钾）、M90（绿肥钾90 kg K₂O ha⁻¹）、K90（化肥钾90 kg K₂O ha⁻¹）、K180（化肥钾180 kg K₂O ha⁻¹）、K90M90（化肥钾+绿肥钾各90 kg K₂O ha⁻¹）及K360（化肥钾360 kg K₂O ha⁻¹），于马铃薯成熟期采集根际土壤，测定理化性质、胞外酶活性及有机质组分（POM、MAOM）。通过宏基因组测序解析微生物群落结构与功能基因，并采用qPCR定量关键氮循环基因丰度，同时测定块茎产量。五年产量数据表明，与无钾对照（K0）相比，化学钾肥和绿肥源钾肥均显著提高了马铃薯产量（图S1）。钾肥与绿肥联合处理（K90M90）的产量始终最高，较K0增产118.6%-411.5%，其次为单施绿肥处理（M90），增产幅度为90.8%-326.6%。以2023年为例，随着钾肥施用量的增加，马铃薯产量较K0提高了61.6%-106.7%，但在2021-2023年间，高钾（K360）和中钾（K180）处理的产量差异不显著。在等钾量条件下（如K90M90与K180相比），钾肥与绿肥联合处理的五年平均产量仍高于单施钾肥处理，增幅达6.5%-35.2%。对不同钾肥梯度处理的土壤理化性质分析表明，与K0相比，360 kg K₂O ha⁻¹（K360）处理的土壤在多项理化指标上均有显著改善（表1）。具体而言，K360处理的土壤pH值较K0提高了约10%，速效钾（AK）含量是K0的5.7倍。K90M90处理的效果尤为显著，其铵态氮（NH₄⁺-N）含量较K0提高了约26.7%，颗粒有机质（POM）和矿物结合有机质（MAOM）含量分别增加了1.4倍和3.5倍。钾肥施用水平显著影响了土壤氮转化基因的丰度（图1）。随着钾肥施用量的增加，关键氮循环相关基因的丰度发生明显变化。高钾处理（K180和K360）下，参与同化和异化硝酸盐还原途径的基因丰度较K0显著升高。基于KEGG注释的微生物功能特征显示，各处理在PCoA中呈现特异性聚类（图2A）。PERMANOVA分析进一步表明，钾肥处理解释了KEGG直系同源组66.0%的变异（P<0.05），而绿肥仅贡献25%的变异（图2B）。钾肥与绿肥联合施用显著提高了马铃薯根际土壤微生物α多样性（Shannon指数，图S2）。在所有处理中，K0处理的多样性最低，随着钾肥施用量的增加而上升，K90M90处理达到峰值。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，细菌和真菌群落的第一坐标轴分别解释42.78%和37.37%的变异，第二坐标轴分别解释23.64%和26.62%的变异。置换多元方差分析（PERMANOVA）表明，绿肥处理与单施化肥处理的细菌和真菌群落分布存在显著差异（P=0.001），物种组成明显不同。图1 不同施钾水平下土壤氮转化相关基因丰度聚类。热图展示了各钾肥处理（K0、M90、K90、K180、K90M90、K360）中氮循环基因Z值的层级聚类，基因根据KEGG直系同源编号（KO）按功能途径（如反硝化、硝酸盐还原、固氮等）分类。图2 根际土壤微生物功能β多样性。（A）基于Bray-Curtis距离的KEGG功能层级主坐标分析（PCoA）；（B）置换多元方差分析（PERMANOVA）解析钾肥与绿肥对KEGG功能水平微生物功能的影响。处理代码：K0：无钾肥；M90：绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹；K180：化学钾肥180 kg K₂O ha⁻¹；K90M90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹+绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K360：化学钾肥360 kg K₂O ha⁻¹。钾肥与绿肥联用显著改变了土壤氮循环相关功能基因的丰度与分布，各处理间差异显著（图3）。与K0处理相比，钾肥及钾肥-绿肥处理均显著降低多数硝化基因（amoA/B/C、hao）和反硝化基因（nirK/S、norB、nosZ）的丰度，而同化硝酸盐还原基因（nasA/B）与异化硝酸盐还原基因（nirB/D、narG/H/I）丰度显著增加。例如，根际土壤异化硝酸盐还原（DNRA）基因narG、narH和narI的丰度分别提升22%-65%、14%-67%和27%-71%；K360处理的同化硝酸盐还原（ANRA）基因nasA和nasB丰度较K0分别增加1.29倍和2.58倍。硝化基因（amoA/B/C）与反硝化基因（nirK/S、norB、nosZ）的丰度变化趋势则与之相反。图3 基于宏基因组测序的氮循环过程基因差异示意图。红色表示该基因在前述处理中持续显著增加，蓝色表示持续显著降低。处理代码：K0：无钾肥；M90：绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹；K180：化学钾肥180 kg K₂O ha⁻¹；K90M90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹+绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K360：化学钾肥360 kg K₂O ha⁻¹。绿肥添加有效抑制了土壤硝化与反硝化作用，关键反硝化基因丰度显著降低。相较于常规K180处理，K90M90（绿肥联用）使nirK、norB和nosZ基因丰度分别下降6.9%、1.5%和26.7%。这种抑制促进了土壤氮循环中的异化硝酸盐还原途径，推动氮素向植物可利用形态转化。K90M90处理的异化硝酸盐还原基因（napA、narG/H/I）丰度较等钾量的K180处理提高6%-14%。而高钾输入（K360）则强化了反硝化作用，其norB和norC基因丰度较K90M90分别增加22%和23%。为阐明无钾与梯度施钾条件下根际氮循环基因丰度差异，采用定量PCR（qPCR）验证宏基因组分析结果。宏基因组数据虽能反映马铃薯根际氮循环基因数量，但无法量化其绝对丰度。qPCR结果显示，与N₂O产生、硝化及异化硝酸盐还原相关的基因丰度存在显著差异（图4）。相较于K0，施钾处理显著影响氮循环基因丰度：所有钾肥处理（K90、K180、K90M90）均显著降低amoA基因拷贝数（P<0.05），降幅分别为85.9%、92.7%和98.6%；nirK基因仅在K90M90处理下被显著抑制60.0%（P<0.05），K90与K180处理则与K0无显著差异；norB基因拷贝数在所有施钾处理中均显著降低（P<0.05），K90、K180和K90M90分别下降41.9%、59.0%和74.5%；而K90M90处理的narG基因丰度较K0提升3.6倍（P<0.05）。这些结果证实，钾肥施用普遍抑制amoA、nirK和norB基因，但强烈促进narG基因表达，其中K90M90处理效果最为显著。图4 不同施钾处理下关键氮循环基因的qPCR分析。（A）amoA，（B）narG，（C）nirK，（D）norB。数据为均值±标准差（n=3），不同字母表示处理间差异显著（*** P<0.001，ns=不显著；单因素方差分析与Tukey HSD检验）。处理代码：K0：无钾肥；K90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹；K180：化学钾肥180 kg K₂O ha⁻¹；K90M90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹+绿肥90 kg K₂O ha⁻¹。与常规K180处理相比，K90M90处理显著降低了反硝化功能微生物的丰度。携带nirK基因的酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）分别减少78%、11%和200%；携带norB基因的酸杆菌门和放线菌门（Actinobacteria）分别降低65%和13%；而携带nosZ基因的酸杆菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门则分别下降53%、6%和20%。硝化作用同样受到抑制，携带amoC基因的硝化螺旋菌门和变形菌门（Proteobacteria）分别减少77%和41%。这些变化发生在nirK、norB和nosZ基因共同贡献超过95%反硝化潜能的背景下，揭示了门级分类单元的特异性响应。例如，nirK基因虽在13个门中被检测到，但在放线菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门和变形菌门中丰度最高（图5，图S3）。K90M90处理特异性降低了携带nirK基因的酸杆菌门和芽单胞菌门丰度，且随施钾量增加抑制效应增强。类似趋势也见于nosZ相关的酸杆菌门/芽单胞菌门，以及norB关联的酸杆菌门/放线菌门。图5 门水平氮循环功能基因携带菌的丰度变化。处理代码：K0：无钾肥；M90：绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹；K180：化学钾肥180 kg K₂O ha⁻¹；K90M90：化学钾肥90 kg K₂O ha⁻¹+绿肥90 kg K₂O ha⁻¹；K360：化学钾肥360 kg K₂O ha⁻¹。由amoABC基因编码的氨单加氧酶催化的氨氧化过程是硝化作用的关键环节，该基因在绿弯菌门、硝化螺旋菌门和变形菌门中被注释。然而施钾处理降低了固氮相关基因nifD的丰度，值得注意的是，所有处理中nifD基因仅在K0处理的厚壁菌门（Firmicutes）中被检出。在氮循环途径中，参与同化（13.7%）和异化（27.6%）硝酸盐还原途径的预测基因占比较高，但功能微生物类群对施肥处理的响应存在差异：napA基因在K90M90处理中仅存在于酸杆菌门，而在低钾处理下于变形菌门中达到最高丰度；外源钾输入显著增加了编码硝酸盐还原酶的narGHI基因和编码亚硝酸盐还原酶的nirB基因总丰度，其中nirB基因主要富集于放线菌门，表明以放线菌门为主导的根际微生物群落可增强根区硝酸盐还原能力。本研究揭示了多途径抑制机制：首先，酸杆菌门对三种反硝化基因（平均降低65.3%）呈现协同性下降，证实其作为关键反硝化菌门的作用；其次，K90M90处理通过激活硝化螺旋菌门的氮保存功能，抑制nirK和amoC基因以阻断反硝化与硝化作用。这些结果表明，钾肥-绿肥的协同效应可有效削弱驱动氮素损失的功能（特别是反硝化和硝化作用）。通过Mantel检验识别影响微生物多样性变化的主要环境因子，发现细菌群落受环境因子影响更为显著。pH、总碳、速效钾（AK）、颗粒有机碳（POC）、矿物结合有机碳（MAOC）及矿物结合有机氮（MAON）均显著改变细菌群落多样性（P<0.05），而真菌群落表现出更强的稳定性，其多样性与pH呈显著负相关（图6A）。Procrustes分析揭示功能基因与环境因子间存在强关联性，表明土壤环境因子是塑造氮循环功能基因的关键驱动因素（图6B）。值得注意的是，携带相同基因的不同微生物类群对施肥的响应存在分化：例如携带nirB基因的诺卡氏菌属（Nocardioides）随施钾量增加而富集，且与土壤AK、MAOC和MAON呈正相关；而携带amoC基因的亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）则随钾水平升高而减少，并与AK、POM及MAOM呈负相关（图6C，图S4）。此外，参与同一氮循环途径的不同微生物类群也表现出差异化的环境适应策略，如携带narG基因的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）与诺卡氏菌属对环境因子的响应存在明显分异。这些结果表明，钾肥施用对氮循环功能基因的影响不仅体现在基因总丰度的变化上，更反映在携带这些功能基因的微生物类群的差异性改变。图6 影响氮循环功能的环境因子与基因相关性分析。（A）基于Bray-Curtis距离和Mantel检验的细菌/真菌群落组成与环境因子交互作用热图，线条宽度表示偏Mantel's r统计量，颜色代表基于999次置换的显著性水平，环境因子间相关性通过Pearson相关系数颜色梯度表示；（B）氮循环功能基因与环境因子关联性的Procrustes分析；（C）功能基因分类优势菌属丰度变化热图及其与土壤性质相关性气泡图。(7)关键物种及氮循环相关功能基因与马铃薯产量的关系采用偏最小二乘路径模型（PLS-PM）解析了不同钾肥施用与土壤环境因子对土壤氮循环、微生物群落组成及多样性以及马铃薯产量的级联效应（图7）。钾肥施用（路径系数=0.86，P<0.001）、土壤微生物群落组成（路径系数=0.65，P<0.001）和多样性（路径系数=0.76，P<0.001）是预测马铃薯产量的关键因子。对微生物多样性具有正向调控的土壤环境因子，同时作为硝化和反硝化途径基因的负向调节因子（路径系数=-0.58，P<0.001）；而硝酸盐同化/异化还原基因则是微生物群落多样性的正向调节因子。具体而言，钾输入显著抑制硝化潜力（硝化指数：NO₃⁻/(NH₄⁺+NO₃⁻)，路径系数=-0.405，P<0.01），从而减少以硝态氮（NO₃⁻-N）为核心的活性氮风险库（作为淋溶和气态损失的直接来源）。钾肥还促进矿物结合有机氮（MAON）和颗粒有机氮（PON）的形成（路径系数=0.544，P<0.001），可解释96.6%的氮保存效率变异（路径系数=0.966，P<0.001）。这些途径间的显著负相关表明，钾肥通过将氮转移至难分解有机组分来减少氮素损失，从而有效固持氮素于土壤系统（图S8）。图7 影响马铃薯产量的关键物种及氮循环相关功能基因的偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析。注：模型展示不同钾肥施用与土壤环境因子对土壤氮循环功能、微生物群落组成及多样性以及马铃薯产量的级联关系。土壤非生物因子包括：pH、总碳（TC）、总氮（TN）、铵态氮（NH₄⁺-N）、硝态氮（NO₃⁻-N）、速效磷（AP）、速效钾（AK）、颗粒有机碳（POC）、矿物结合有机碳（MAOC）、颗粒有机氮（PON）和矿物结合有机氮（MAON）。DNRN：异化硝酸盐还原，ANRN：同化硝酸盐还原。路径系数反映变量间关系的方向与强度，决定系数（R²）表示潜在变量的解释方差。蓝色与红色箭头分别表示正相关与负相关，箭头旁数值为路径系数，宽度代表系数强度。*、**和***分别表示P<0.05、0.01和0.001的显著性水平。随机森林模型确定了环境因子预测马铃薯产量的重要性排序。钾肥施用直接正向调控土壤环境因子、硝酸盐同化/异化还原途径及马铃薯产量。随机森林分析显示，土壤环境因子、微生物组成与多样性共同解释了52.8%的产量变异（R²=52.8%）。其中，土壤钾氮相对有效性对产量影响最为关键，其次为速效钾（AK）和微生物群落多样性。此外，矿物结合有机氮（MAON）和矿物结合有机碳（MAOC）对产量的贡献度分别使均方误差（MSE）增加3.89%和3.70%。本研究系统探究了土壤氮（N）循环功能基因及微生物类群对不同梯度化学钾肥与绿肥源钾肥联合施用的特异性响应。钾肥施用改变了氮循环功能类群的分布格局，导致土壤微生物群落功能冗余；携带不同氮代谢基因的微生物对施肥处理表现出梯度依赖性敏感。其中nirB、nirD等关键基因及氮同化功能类群（如诺卡氏菌科Nocardioidaceae）的丰度动态与土壤理化性质（速效钾AK、矿物结合有机碳MAOC和矿物结合有机氮MAON）的变化显著相关。钾肥通过抑制硝化-反硝化过程减少气态氮损失，同时激活硝酸盐同化/异化还原双途径，使土壤氮固持率提升，马铃薯增产幅度达62%-119%。值得注意的是，绿肥与高钾联用引发碳氮协同稳定效应，其MAOC和MAON含量较单施钾肥处理分别提高1.52倍和1.89倍，证实矿物界面驱动的共固定机制可延长氮滞留时间。这些发现阐明了微生物类群-功能基因-作物生产力间的级联关系，为通过定向调控微生物群落提升农业生态系统可持续性提供了可操作的理论依据。
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