国自然|东北农业大学江连洲教授、齐宝坤教授:大豆亲脂蛋白-绿原酸碱、酶和自由基共价结合体系的构象变化、功能性质及复合机制的研究
本文获国家自然科学基金面上项目（32472266）。
为明晰大豆亲脂蛋白（soybean lipophilic protein，LP）与绿原酸（chlorogenic acid，CA）碱、酶和自由基共价结合对蛋白质构象和功能性质的影响及复合机制，本研究综合运用粒径和 Zeta 电位、电泳技术、多光谱技术、差示扫描量热、流变、扫描电镜、抗氧化性分析等方法对不同制备条件下复合物的分子量、二级和三级结构、热稳定性、流变性和抗氧化性等功能性质进行表征。结果表明：LP 在自由基、碱、酶条件下的多酚结合率依次升高，粒径和 Zeta 电位绝对值均高于 LP；复合物中的游离氨基和巯基含量较 LP 降低，但二硫键含量升高，其中酶法复合物变化最明显；CA 的引入使 LP 的电泳条带上移，LP 分子中的亚基变性为小分子亚基，自由基、碱、酶复合物的变性情况愈加显著；自由基复合物、酶法复合物和碱法复合物的离子键含量较 LP 依次增加，疏水作用力依次减小；圆二光谱和傅里叶红外光谱结果表明 CA 与 LP 复合成功，二者主要通过 C-N/C-S 键连接，复合物的无规则卷曲含量升高，β-折叠和 β-转角含量降低，碱法复合物的二级结构变化最为显著；荧光结果显示酶法复合物的荧光猝灭效果最强，碱法复合物次之；复合物的表面疏水性降低，碱法复合物的表面疏水性最低；复合物尤其是碱法复合物的热稳定性和流变性能增强；CA 的加入使 LP 的表面出现较多突起和孔隙，自由基复合物、酶法复合物、碱法复合物的微观形貌愈加均匀致密；LP-CA 共价复合物的抗氧化能力在消化后升高，且自由基复合物均拥有最强的抗氧化能力，酶法复合物的抗氧化能力最弱。本研究可为 LP-CA 复合物作为功能成分加以应用以及开发含 CA 的大豆蛋白产品提供理论依据。作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。近年来，利用替代配料设计新的食品结构或增加食品中的功效成分，以提高食品品质受到广泛关注。在植物蛋白中，大豆亲脂蛋白（soybean lipophilic protein，LP）是一种富含卵磷脂的大豆蛋白，其极性脂质含量约为 8%~10%，主要是磷脂。LP 有许多功能特性，如乳化、发泡和凝胶性等，被用于食品的开发和研究，但也存在不稳定或功能性较低的情况，有研究发现蛋白质与多酚结合可以改善蛋白质的功能特性或增强其稳定性。与此同时这些功能与蛋白质-多酚相互作用机制和蛋白质构象密切相关。例如，Zhong 等发现在 LP 中加入表儿茶素可以改变LP 的二级和三级结构，两者主要通过疏水相互作用与 LP 非共价结合。Dai 等研究了大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）与儿茶素之间的非共价相互作用，发现儿茶素的引入导致 SPI 聚集并形成网状结构，SPI 的 α-螺旋和 β-折叠转变为 β-转角和无规则卷曲，SPI 与儿茶素之间的相互作用力主要是疏水相互作用和氢键。Yan 等证实了 SPI-没食子酸（GA）共价结合主要通过 C-N 键连接，具有优异的抗氧化性能，提高了 SPI 结构的柔性。综上所述，研究多酚与 LP 的结合机制及其对 LP 构象的影响有助于改善 LP 的功能特性，深入优化食品体系，改善食品品质。多酚是一类含有多个酚羟基的芳香族化合物，其核心结构为苯环，常带有羟基、羧基或酯键等官能团，可分为酚酸类、黄酮类、单宁类等。绿原酸（chlorogenic acid，CA）是有极性的有机酸，是由咖啡酸和奎宁酸通过酯键结合而成的活性酚酸。奎宁酸部分为环状结构（环己烷衍生物），而咖啡酸部分为苯丙烯酸结构。绿原酸分子中含有多个酚羟基（如邻二酚羟基）和部分羧基，使绿原酸具有抗氧化能力和一定的酸性。CA 在 pH 偏碱性的环境下可被水解氧化成醌类。绿原酸具有广泛的生物活性，具有抗氧化作用，能够清除自由基并抑制氧化应激，绿原酸还具有抗炎活性、调节血糖、抗菌、抗病毒、保护心血管等作用，这些特性使其在食品、医药和保健品领域具有广泛的应用潜力。蛋白质与多酚的不同相互作用对蛋白质功能特性的改善有不同程度的影响。共价结合包括碱法共价结合、酶法共价结合和自由基法共价结合，共价结合依托较强的共价键，其原子间紧密的电子对共享，赋予了共价复合物卓越的稳定性，对环境因素（如温度、离子强度、pH 或成分相互作用）适应性更强，这使得多酚得以更稳定地应用于食品中。近年来，人们对大豆蛋白分离、11S、7S与多种植物多酚之间的相互作用进行了广泛的研究，但 LP 与多酚特别是与 CA 之间的相互作用尚未得到深入研究。且以往对蛋白质与多酚相互作用的研究主要集中在非共价或某单一共价结合模式上，缺乏共价结合方式的全面比较。为了进一步了解植物多酚与蛋白质之间的相互作用，本研究深入探讨了 LP 与 CA 之间的三种共价结合方式（碱共价、酶共价和自由基共价结合）的机制，综合分析了 LP 和 CA 的不同结合方式下 LP 分子量、二级结构和空间构象的变化以及对其功能性质的影响，以期为在食品系统中开发具有提高蛋白质功能性质和生物活性的新复合物提供参考。2.1 LP 与 CA 结合特性分析
多酚结合率反映了蛋白质和多酚之间的结合程度。不同结合方式下 LP-绿原酸复合物的多酚结合率示于表 1 中。可以看出 LP-Cf、LP-Ca 和 LP-Ce 的多酚结合率依次升高，这说明 LP 与 CA 在不同的共价结合条件下与 CA 发生的交联程度有所差别，且在酪氨酸酶的存在下，LP 与 CA 交联最紧密，与 CA 的结合率达到最高的67.43%。酶法与碱法表现出更高的多酚结合率，蛋白质的共价修饰优先发生在赖氨酸的 ε 氨基和半胱氨酸的巯基上，在酶和碱性条件下它们会预先转化为醌。而自由基结合方式中产生的羟自由基对蛋白质侧链的氨基酸氧化速度较慢，所以复合反应的效率相对较低，从而 LP 与 CA 结合较少。Table 1 Polyphenol binding rates of LP under different binding modes
用平均粒径来反映CA与LP复合物的平均粒径 结合后的聚集现象。图 1 显示了 LP 和LP-CA 复合物的平均粒径和 Zeta 电位。三种共价复合物的平均粒径均大于 LP 且 LP-Ce 的平均粒径在共价复合物中最大，比 LP 平均粒径高 1.24 倍。这说明多酚复合到蛋白质分子上使蛋白质的分子量增加。酶促机制增强了多酚类物质的催化氧化作用，使 CA 与蛋白质的结合程度更大，故以酶法结合的LP-CA 复合物粒径的增加最为明显。Zeta 电位反映了溶液中粒子表面的电荷强度，反映了静电斥力或引力的大小。如图 1 所示，所有样品都表现出很强的负 Zeta 电位。CA 的引入增加了 LP 表面负电荷的含量，故 LP-CA 共价复合物的绝对电位高于 LP。由多酚结合率结果可知，由于酪氨酸酶的作用，LP-Ce结合了更多的 CA，使 LP 表面负电荷增加最多，故此条件下形成的复合物离子之间的静电斥力最大，绝对电势最高。Dai 等发现儿茶素与大豆分离蛋白共价结合使 LP 表面负电荷增加，与本研究结果一致。
图 1 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的粒径和 Zeta 电位
Fig.1 Particle size and Zeta potential of LP and different covalent complexes of LP-CA
注 ：图 中 不 同 字 母 表 示 样 品 间 存 在 显 著 性 差 异 （ P<0.05） ，图 2、图 4、图 8、图 13 同。
2.2 活性基团含量分析
多酚在有氧条件下容易被氧化成半醌基团，然后重排成醌基团，这些基团与 LP 侧链中的亲核氨基酸残基相互作用，使 LP 中游离巯基和氨基损失，这是多酚修饰蛋白质的典型指标。图 2A 显示了LP-CA 共价复合物中游离氨基含量的变化。结果表明，所有 LP-CA 复合物的游离氨基含量均低于 LP，尤其是 LP-Ce。这是因为 CA 消耗蛋白质侧链上的氨基形成 C-N 键，因此蛋白质分子中游离氨基的数量减少，而酶促机制使 LP 和 CA 之间的结合程度最高，消耗的氨基数量最多。自由基法中产生的羟自由基将 LP 侧链的氨基氧化成自由基可与氨基反应，但由于产生的多是羟基自由基，形成的 C-N 键较少，自由基复合物的氨基含量降低较少。巯基是蛋白质中具有活性的还原性基团，对维持蛋白质的生理活性和结构稳态起着重要作用。LP 及其复合物的游离巯基及二硫键含量如图 2B 所示。LP-CA 三种复合物中游离巯基的含量较 LP 中都减少。这是因为 LP 在共价结合过程中分子中的巯基被 CA 氧化，所以其巯基含量降低。而 CA 分子中的羧基在酶的作用下更容易与 LP 中的巯基结合，导致 LP-Ce 共价复合物中游离巯基含量较 LP 降低最为显著。二硫键是相对稳定的共价键，对蛋白质多肽空间结构的稳定起作用。与游离巯基结果相反，复合物的二硫键含量大于 LP，这是由于游离的巯基在与 CA 成键时除去氢离子而转化为二硫键。
图 2 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的游离氨基含量（A）、游离巯基含量和二硫键含量（B）
Fig.2 Free amino group content (A), free thiol content, and disulfide bond content (B) of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.3 LP-CA 相互作用及分子量变化分析
2.3.1 SDS-PAGE 分析
图 3 显示了样品的 SDS-PAGE 图谱，LP 具有脂氧合酶（94 kDa）、7S（50~71kDa）、11S（20~35 kDa）以及 24 kDa、18 kDa 等膜蛋白条带，这表明 LP 变性为小分子量亚基。所有复合物的条带均向上移动，说明 CA 与 LP 形成了具有更大分子量的蛋白质聚集体，即二者进行了有效结合。此外，SDS 和 β-巯基乙醇可以破坏蛋白质的非共价相互作用及次级共价键，排除了非共价作用的影响。上移程度由大到小依次为 LP-Ce、LP-Ca、LP-Cf，这是因为在酶法和碱法条件下，LP 侧链上的氨基、巯基等更易与 CA 结合。另外可以从图中看出，共价复合物的条带逐渐减少，尤其是 LP-Cf 的条带减少最明显，这是因为在自由基途径中，H2O2-VC 还原系统将蛋白质侧链氧化后与 CA 结合形成的复合物为不溶性的大分子聚合物，这些聚合物可在离心时形成沉淀导致可溶性蛋白含量减少。Dai等通过大豆分离蛋白与儿茶素共价复合的电泳条带证实了复合物的形成，与本实验结果一致。
图 3 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的 SDS-PAGE
Fig.3 SDS-PAGE of LP and different covalent complexes of LP-CA
注：条带 1：LP；条带 2：LP-Ca；条带 3：LP-Ce；条带 4：LP-Cf。
2.3.2 分子间相互作用力分析
通过测定 LP 和三种不同结合方式的复合物在不同溶剂中的溶解度，可以分析蛋白质分子在不同溶液中的分子间作用力。LP 及其复合物的分子间相互作用力如图 4 所示。由于多酚引入了大量带负电荷的羟基，为蛋白质聚集提供了足够的阴离子（离子键），碱法、酶法、自由基法制备的 LP-CA 复合物的离子键含量较 LP 分别增加 2 个百分点、1.2 个百分点和 1 个百分点。从图中可看出，共价复合物分子之间的氢键含量也高于 LP，而疏水作用力却低于 LP，因为共价结合引入的酚羟基不仅提供阴离子，还与蛋白质主链的肽基团以及侧链上的-OH、-NH2 和-COOH 多点结合形成氢键，而水分子间氢键的不稳定性阻碍了疏水水合作用。在三种共价复合物中，LP-Ca 具有最高的离子键和氢键含量，这是因为碱性环境为溶液系统提供了更多的阴离子和阳离子来驱动蛋白质聚集，并提供了更多的 OH−使 LP 和 CA 之间形成氢键。
图 4 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的分子间相互作用力
Fig.4 Intermolecular interaction forces in LP and different covalent complexes of LP-CA
2.4 二级结构分析
2.4.1 CD 光谱分析
使用 CD 光谱法测定 LP-CA复合物的二级结构。蛋白质的圆二色谱如图 5A 所示，LP 与所有复合物在 200~205 nm 处有明显负峰，在 195 nm 处有明显正峰，且除 LP-Ca 外在 208 nm和 222 nm 附近有明显负峰，分别对应蛋白质的无规则卷曲、β-折叠和 α-螺旋结构。碱法复合物在208 nm 和 222 nm 无特征峰即碱法复合物二级结构变化最明显，表明四种结合方式中碱法结合使 CA 更多地复合到 LP 分子中，对 LP 结构变化影响最明显。另外，LP-Cf、LP-Ce 和 LP-Ca 共价复合物的峰值较 LP 依次增大，且峰位蓝移程度也依次增大，说明 CA 成功复合到 LP 分子中且形成了新的氢键，LP 的圆二色性随之发生改变。照应分子间相互作用力研究中分子间氢键含量增加的结果。
图 5 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的 CD（A）、二级结构含量（B）
Fig.5 CD spectra (A) and secondary structure content (B) of LP and different covalent complexes of LP-CA
以图 5A 为基础，通过计算得到 LP 及 LP-CA复合物二级结构含量的变化如图 5B 所示。LP-CA复合物的二级结构含量在三种共价相互作用驱动下均发生了改变。与纯蛋白质相比，CA 复合到 LP 分子中增加了其无规则卷曲的含量，与之对应的是 β-折叠和 β-转角的含量减少，这是因为 CA 与 LP 的共价相互作用使蛋白质原有的二级结构更加分散，并诱导 β-折叠向无规则卷曲的转化，表明 CA 的复合使LP 的主链骨架更具弹性，蛋白质增加的无规卷曲含量也可能与疏水性氨基酸如色氨酸和酪氨酸的暴露有关。尤其是碱法复合后蛋白的二级结构变化最明显，无规则卷曲含量增加至 23.2%，β-折叠含量降低至 32.9%，酶法与自由基法复合对 LP 二级结构的影响小于碱法方式复合。2.4.2 FTIR 分析
傅里叶变换红外光谱是用于蛋白质结构表征的光谱技术。将酚类化合物引入蛋白质骨架中将改变蛋白质的结构和物理化学性质。通过四种方法制备的 LP-CA 复合物的 FTIR 光谱示于图 6 中。LP 的光谱在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和酰胺 A 带处显示出特征峰。LP-CA 复合物的 FTIR 光谱强度相对于 LP 更强且更窄，表明 CA 成功复合到 LP分子中，酰胺数量增加。共价复合物在酰胺 A 带的峰位发生红移，说明 LP 和 CA 之间的相互作用由氢键诱导；复合物在酰胺Ⅱ带发生蓝移，在酰胺Ⅲ带发生红移，LP-Cf、LP-Ce、LP-Ca 的偏移程度逐渐变大。这些结果表明，LP-CA 复合物形成，且复合物中蛋白质的-NH2 参与了共价反应，而在碱性条件下，LP 结构解离程度最大，暴露出更多的-NH2 与 CA共价结合。另外，与 LP 相比，复合物在 1073.82 cm−1处的峰强度也显著增加，该谱带归属于酚-OH 基团的 C-O 伸缩振动，进一步证实绿原酸成功地复合到LP 上，即 LP-CA 复合物形成。以上结果表明，LP 与 CA 结合成为共价复合物，二者之间的相互作用引起了多个官能团的拉伸和弯曲，改变了 LP 的分子结构。
图 6 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的 FTIR
Fig.6 FTIR of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.5 三级结构分析
2.5.1 荧光光谱分析
内源荧光光谱可用来探究蛋白质和多酚之间的相互作用，通过监测荧光团对微环境的敏感性提供有关蛋白质空间构象的信息。图 7 为 LP 及其复合物的荧光光谱。LP 的最大发射波长约为 334 nm。CA 的苯环与 LP 中的芳香氨基酸残基（色氨酸）结合，掩盖了荧光发色基团，故与LP 相比所有复合物的荧光强度降低。三种共价方法的荧光强度由低到高依次为酶法、碱法和自由基法。CA 与 LP 中的亲核氨基酸残基通过形成 C-N、C-S 等共价键，使更多的色氨酸残基接触到亲水环境，从而产生更强的荧光猝灭效应。酪氨酸酶的催化作用更能提高大豆亲脂蛋白的分子柔性，使更多的色氨酸残基暴露于亲水环境中，从而使蛋白质中色氨酸残基与多酚结合更多，荧光猝灭效果更强。Jannasch 等发现多酚会使蛋白质的三级结构改变。
图 7 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的内源荧光光谱
Fig.7 Intrinsic fluorescence spectra of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.5.2 表面疏水性分析
蛋白质表面疏水性通过调控疏水核心的稳定性及分子间相互作用，直接影响蛋白质三级结构。从图 8 可以看出，LP-CA 复合物的 H0 均低于 LP 的 H0，这是由于 LP 与 CA 的共价相互作用使 LP 的构象发生改变，LP 中的色氨酸等疏水性基团暴露出来以及 CA 中新的亲水性基团（羟基和羧基）的引入使 LP 的 H0 降低。这一现象在之前的研究中已经得到证实。此外，ANS 对蛋白质表面电荷变化很敏感，LP 与 CA 相互作用引起的蛋白质聚集增加会导致 ANS 与 LP 可结合的表面积减少，故 LP 表面疏水性表现出降低现象。在共价复合物中，碱共价作用使 LP 的 H0 降低幅度最大，表明LP 三级结构在 pH9.0 时展开程度更大，暴露出更多与 CA 结合的侧链基团，并限制了 ANS 与 LP 的结合，从而使蛋白质的表面疏水性降低，符合 CD 光谱和 FTIR 光谱研究的结果，即碱法复合物的三级结构变化最明显。Wang 等也发现核桃蛋白与绿原酸结合后的复合表面疏水性降低。
图 8 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的 H0
Fig.8 H0 of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.6 热稳定性分析
为了进一步探讨 LP 和 CA 之间的三种共价相互作用对复合物热稳定性的影响，对 LP 和 LP-CA复合物进行了 DSC 分析。DSC 测定的变性温度反映了蛋白质结构的稳定性。表 2 显示了 LP 和LP-CA 复合物的变性温度（Td）及焓变（ΔH），与 LP相比，LP-Cf、LP-Ce 和 LP-Ca 的变性温度依次升高，这是由于 CA 结构中的酚羟基与 LP 结合时形成了大量的氢键，使复合物的稳定性增强。由于 LP-Ca 的分子间氢键数最多，且 LP-Ca 比 LP-Ce 和 LP-Cf 含有更多的 β-转角含量，而 β-转角含量的微小变化可引起变性温度的较大变化，这一结论已被证实，故而 LP-Ca 的 Td 最大。另外从表 2 中可看出 LP-CA复合物的 ΔH 值大于 LP。CA 的引入使 LP 的结构展开并发生重排，形成了更稳定的复合物构象即具有更紧密的分子结构，需要更多的能量来展开，故共价复合物的 ΔH 值大于 LP 的 ΔH 值。另外，CD 光谱表明碱性共价结合对蛋白质结构的影响最大，与ΔH 结果一致。Liu 等研究乳清蛋白与不同膳食多酚的相互作用中也发现蛋白-多酚共价结合会使蛋白质的热稳定性增强。表 2 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的变性温度（Td）和焓变（ΔH）
Table 2 Denaturation temperature (Td) and enthalpy change (ΔH) of LP and different covalent complexes of LP-CA
注：同列不同字母表示变性温度（Td）和焓变（ΔH）在LP-CA不同复合物中存在显著性差异（P<0.05）。
2.7 流变性能分析
流变特性是蛋白质关键的功能特性之一，其变化将影响食品或材料的加工条件和方式。图 9 显示，所有试样的 G’和 G”均随应变的增大而减小，且在应变范围内 G’和 G”出现交点，表明样品的微观界面被破坏。应变扫描结果中发现 LP-Ca、LP-Ce、LP-Cf、LP 向粘性转变的应变数值逐一减小，这归因于 CA 的引入使蛋白质粘弹性增大。在 0.1%~100%应变范围内，3 种共价复合物中 LP-Cf 的模量最低，分子间相互作用较弱；LP-Ca 的模量最高，意味着分子间相互作用较强，能够形成相对稳定的聚集体。样品分子间较强的相互作用能有效减缓剪切变稀现象，所以可以通过提高复合物的稳定性来增强其流变特性。图 10A 和 B 展示了样品在 0.1~10 Hz 频率范围内的模量变化。LP 的 G’和 G”最低，其次为LP-Cf，而 LP-Ca 的 G’和 G”最高，这种现象是由 LP-CA 复合物上的苯酚基团与蛋白质之间的交联以及氢键和酰胺键的形成引起。与应变扫描结果趋势相近，LP 与 CA 的三种共价结合均提升了蛋白溶液的粘弹性，聚集行为强于 LP，更容易形成聚集体长链结构。如图 11 所示，所有样品的表观粘度随着剪切速率的增加而降低，该结果反映了蛋白溶液出现剪切变稀现象，属于非牛顿流体。样品的表观粘度由大到小依次为 LP-Ca、LP-Ce、LP-Cf、LP，表观粘度变化规律符合上述分析结果。
图 9 LP 和 LP-CA 不同共价复合物在 0.01%~100% 应变范围内的储能模量（G’）和损耗模量（G”）
Fig.9 Energy storage modulus (G') and loss modulus (G") of LP and different covalent complexes of LP-CA in the strain range of 0.01%~100%
图 10 LP 和 LP-CA 不同共价复合物在 0.1~10 Hz 频率范围内的 G’（A）、G”（B）Fig.10 G' (A) and G" (B) of LP and different covalent complexes of LP-CA in the frequency range 0.1~10 Hz
图 11 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的表观粘度
Fig.11 Apparent viscosity of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.8 微观形态分析
LP 和 LP-CA 复合物的 SEM 微观结构如图 12所示。LP 表面较为光滑，仅存在少量突起结构。而LP-CA 复合物微观形貌较 LP 形成更多突起以及较多孔隙。其中 LP-Cf 的表面变化最小，突起和孔隙较少；LP-Ce 表面出现较多突起和孔隙，且形成的突起较为均匀，孔隙较 LP-Cf 也更多，孔径变小；LP-Ca微观结构变化最明显，其微观形貌表现出多且均匀的突起，同时其含有最多、孔径最小且分布最均匀的孔隙。这些微观形态的变化证实了 CA 与 LP 的成功复合。本文的研究结果表明 LP 分子中的氨基和羧基与 CA 的羟基在共价相互作用过程中发生反应，导致 LP 与 CA 的交联更加紧密，与前人研究的均匀致密的微观结构结果相似。而 LP-Ca 的微观结构最均匀致密，说明在碱性条件下 LP 与 CA 发生的交联最紧密。
图 12 LP 和 LP-CA 不同共价复合物的 SEM 图
Fig.12 SEM images of LP and different covalent complexes of LP-CA
2.9 体外消化前后的抗氧化能力分析
采用 DPPH 和ABTS+自由基清除活性指标测定蛋白质及其多酚复合物的抗氧化能力。如图 13 所示，复合物的抗氧化能力明显高于 LP，说明 CA 的引入增强了 LP 的抗氧化能力。消化后的复合物比未消化的复合物具有更高的抗氧化能力，这表明复合物在胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用下被分解成小分子物质使 CA 暴露出来，LP 被分解成具有抗氧化能力的小分子多肽，与 LP 的磷脂发生协同作用，提高了 LP 的抗氧化能力。与 Li 等研究结果一致。对于 LP-Cf，H2O2-VC 还原体系与羟基的协同作用使得其具有最强的 DPPH 和ABTS+自由基清除能力。此外，由于酪氨酸酶的存在增强了酚羟基的交联作用，使 LP-Ce 的抗氧化能力在共价复合物中最低。
图 13 LP 和 LP-CA 不同共价复合物体外消化前后的 DPPH 自由基清除能力（A）、ABTS+自由基清除能力（B）
Fig.13 DPPH free radical scavenging ability (A) and ABTS+ free radical scavenging ability (B) before and after digestion of LP and different covalent complexes of LP-CA in vitro
2.10 LP 与 CA 共价结合机制
蛋白质与多酚的碱法共价结合、酶法共价结合和自由基法共价结合机制的示意图如图 14 所示。在碱性条件下（pH9.0），绿原酸的羟基被氧化形成醌，醌基团与其他 CA 形成二聚体，发生去质子化反应。醌基和这些二聚体比单体具有更低的氧化还原电位，因此具有更高的活性，易与 LP 侧链上的亲核基团或侧链上的氨基酸（如胺、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸等）相互作用形成 C-N、C-S 等共价键。酪氨酸酶存在的环境下，LP 和CA 的反应机制相似，酪氨酸酶的主要作用是催化绿原酸酚羟基生成醌的交联反应。在自由基途径中，H2O2和抗坏血酸还原对形成羟基自由基，这些羟自由基与 LP 中氨基和巯基上的氢原子反应生成蛋白自由基，生成的蛋白自由基与 CA 中的芳香基形成共价键。
图 14 蛋白质与多酚的碱法共价、酶法共价和自由基法共价结合机制
Fig.14 Mechanism of covalent bonding between protein and polyphenol by alkali, enzyme and free radical methods
本研究阐明了 LP 与 CA 碱法、酶法和自由基法三种共价结合对蛋白质结构和功能性质的影响并深入探究了二者共价结合机制。结果表明，在酶催化下 LP 结合的 CA 含量最多，自由基条件下结合的CA 最少，受多酚结合含量的影响，自由基复合物、碱法复合物和酶法复合物的粒径、Zeta 电位绝对值的变化情况愈加显著，并依次显著提升（P<0.05）。从SDS-PAGE 结果来看自由基复合物、碱法复合物和酶法复合物的分子量和条带变化依次增强，说明酶法复合物的聚集行为较强，自由基复合物最弱。三种共价结合方式均导致 LP 二级和三级结构解折叠及疏水基团暴露，其中碱法引起的结构解离程度和活性基团暴露最为显著，酶法次之，自由基法相对最弱。LP、自由基复合物、酶法复合物和碱法复合物的Td 和 ΔH 依次增大，说明 CA 的加入增强了 LP 的热稳定性。流变、体外消化前后的抗氧化结果表明，LP 与 CA 的复合提升了蛋白质的流变性能和抗氧化能力，且 LP-CA 复合物在体外消化后的抗氧化活性高于消化前的抗氧化活性。另外，与 CA 复合后，LP 的微观结构发生变化，这说明 LP 分子中的氨基和羧基与 CA 的羟基在共价相互作用过程中发生反应，导致 LP 与 CA 的交联更加紧密，碱法复合物分子间相互作用力变化最明显，热稳定性最好，模量和表观粘度最优均充分证实了碱性条件（pH9.0）是LP 与 CA 结合效果最好的环境。这些结果为研究蛋白质与多酚类物质之间的共价相互作用提供了参考，也为大豆亲脂蛋白与绿原酸复合物在食品工业中的应用奠定了理论基础。引用本文：刘盼玲，唐诗琦，闫世长，等. 大豆亲脂蛋白-绿原酸碱、酶和自由基共价结合体系的构象变化、功能性质及复合机制的研究[J]. 食品工业科技，2026，47（5）：80−91. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025020085.
Citation：LIU Panling, TANG Shiqi, YAN Shizhang, et al. Conformational Changes, Functional Properties and Complexation Mechanisms of Soybean Lipophilic Protein-Chlorogenic Acid Alkaline, Enzymatic, and Free Radical Covalent Binding Systems[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026, 47(5): 80−91. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025020085.
江连洲，东北农业大学首席教授、博士生导师，历任食品学院院长、国家大豆工程技术研究中心主任等职。现任国际食品科学院（IAFoST）院士、国务院学位委员会学科评议组成员、美国油脂化学家学会（AOCS）中国分会主席、中国大豆产业协会副会长等职。获得国务院特殊津贴、AOCS杰出成就奖、中国发明协会会士、中国食品科学技术学会会士等各级各类荣誉称号30余次。40多年来专注于大豆加工理论研究、技术创新和人才培养，在创新大豆蛋白质柔性化加工和油脂生物解离机制理论体系、突破大豆高值化加工技术瓶颈、实现工程化应用等方面取得了一系列原创性科技成果。始终坚持以“四个面向”为导向，主导创建了以产品高端化、生产高效化、资源高值化为特征的具有自主知识产权的中国大豆工程化技术体系，为推动我国大豆产业振兴与发展做出突出贡献。主持完成联合国开发计划署、国家“863”计划、国家自然科学基金重点、国家重点研发计划等50余项重大科技项目。发表论文450余篇（其中SCI论文268篇，ESI高被引论文17篇，热点论文8篇），被引9247次，H指数46，出版著作11部（独著3部）；获授权发明专利105件；获科技奖励30余项（包括国家科技进步二等奖2项、省自然科学一等奖1项、省技术发明一等奖1项、省科技进步一等奖2项等）。同时在人才培养、团队与学科建设和工程技术平台构建方面成效显著，出色发挥了在学科及行业中的领军作用。特别是在大豆精深加工领域突破多项“卡脖子”关键技术，取得了丰硕的成果，显著提升了我国大豆加工业科技水平，为我国粮油加工产业技术进步做出突出贡献。
（以上信息来自东北农业大学官网）
齐宝坤，教授、博士研究生导师，龙江科技英才春雁团队带头人，黑龙江省中蒙俄农产品生物加工及装备研发联合实验室副主任，黑龙江省创新人才，东北农业大学学术英才、学术骨干、青年才俊，入选2024年度“全球高被引科学家”名单、 “全球前2%顶尖科学家”榜单、“中国知网高被引学者”榜单。先后主持包括国家自然科学基金（青年、面上）、国家十四五重点研发计划子课题、黑龙江省重大专项在内的科研项目18项，黑龙江省教学改革项目1项；以第一/通讯作者发表论文163篇，其中SCI检索论文111篇（中科院一区Top论文95篇，ESI检索11篇，封面3篇），EI检索论文42篇；作为主编编著CRC英文专著1部，副主编参编教材3部；授权国家发明专利55项，技术转让发明专利15项；获得包括吉林省科技进步一等奖、黑龙江省科技进步二等奖、中国轻工业联合会科学技术发明一等奖在内的等省部级奖励11项。
或登录www.spgykj.com阅览全文。
群聊：食品工业科技作者群
我刊正式组建微信作者群，为作者提供更多的学术与论文资讯，如需进群，请联系刘老师（微信：上方二维码,电话：87244117-8062）。
《食品工业科技》具有以上论文在全世界范围内的复制权、发行权、翻译权、汇编权、广播权、表演权、信息网络传播权、转许可权及以上权利的邻接权，且作者已授权期刊同论文著作权保护期。如需转载，可联系《食品工业科技》编辑部010-87244116，或直接在文末撰写转载来源。
10个月宝宝每天需要喝多少奶粉？
