东北农业大学 | 呕吐毒素致肾损伤新机制:自噬流紊乱是关键推手

研究亮点

首次在体内外证实 DON 通过阻断自噬体形成、诱发线粒体损伤、触发铁死亡、引发 Fe²⁺介导溶酶体功能障碍，形成恶性循环导致肾小管损伤；系统阐明自噬流紊乱在 DON 肾毒性中的核心作用，为霉菌毒素肾损伤防治提供全新靶点与理论依据。

研究背景

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是污染谷物与饲料最普遍的霉菌毒素，检出率高达 90% 以上，可通过食物链进入动物与人体，引发肠道、肾脏、肝脏等多器官毒性。肾脏是 DON 主要代谢器官，其诱导肾损伤的核心机制尚不明确。已知氧化应激是 DON 肾损伤关键诱因，而氧化应激常伴随自噬流改变，自噬对维持细胞稳态至关重要，且线粒体自噬异常、铁死亡、溶酶体功能均与氧化损伤密切相关。当前缺乏对 DON 暴露下肾脏自噬流、线粒体、铁死亡、溶酶体协同作用的系统解析，厘清这一机制对防控 DON 相关肾损伤、保障饲料与食品安全具有重要理论与应用价值。

研究方法

• 样品检测：采集猪配合饲料、玉米、麦麸、豆粕，用 ELISA 试剂盒测定 DON 含量；

• 动物实验：C57BL/6 小鼠分为对照、低 / 高剂量 DON 组，连续灌胃 4 周，检测血清生化、肾组织病理、蛋白表达；

• 细胞实验：以小鼠肾小管上皮 TCMK-1 为模型，DON 处理后开展功能验证；

• 组学与成像：蛋白组学分析通路差异，透射电镜、原子力显微镜观察细胞器与细胞形态，GFP-mCherry-LC3B 检测自噬流，荧光探针检测 ROS、Fe²⁺、线粒体功能、溶酶体；

• 分子检测：Western blot、免疫组化检测自噬、铁死亡、溶酶体相关蛋白，统计分析组间差异。

研究结果

饲料中 DON 检出率 91.7%–100%，配合饲料超标率 23.2%；DON 暴露抑制小鼠生长、升高肾损伤指标，引发肾小管上皮变性、纤维化与线粒体结构破坏；细胞水平 DON 上调 ROS、脂质过氧化与 Fe²⁺水平，下调 Xc 系统与铁蛋白，诱导铁死亡；DON 抑制 ATG4B、阻碍 LC3Ⅰ 向 LC3Ⅱ 转化，导致自噬体形成障碍、自噬流阻断；受损线粒体大量产超氧阴离子，进一步加重氧化损伤；Fe²⁺向溶酶体聚集，使 LAMP1 升高、LAMP2/CTSB/CTSD 降低，引发溶酶体功能障碍，形成恶性循环，线粒体抗氧化剂与铁螯合剂仅能部分缓解损伤。

Figure 1 饲料样本中 DON 污染分布与含量情况

这组图通过对猪配合饲料、玉米、麦麸、豆粕共 243 份样本进行 DON 含量检测，以大于 100 μg/kg 为阳性标准，直观呈现出各类饲料原料与全价料中 DON 的广泛污染状态，其中猪配合饲料阳性率达 100%、玉米 96.8%、麦麸 97.8%、豆粕 91.7%，同时标注出不同饲料中 DON 的最高浓度、平均值以及超标比例，猪配合饲料超标率达 23.2%，充分证实实际生产中饲料受 DON 污染普遍且部分样本超标严重，为后续动物实验剂量设置提供了真实可靠的现场数据支撑，也反映出 DON 污染对饲料安全与畜禽健康存在切实威胁。

Figure 2 DON 暴露诱导小鼠肾小管损伤与铁死亡发生

该图围绕 DON 灌胃处理 4 周小鼠的体内实验展开，从整体动物表型、血清生化、肾脏病理、细胞器形态及分子标志物多维度验证 DON 的肾毒性，结果显示 DON 会抑制小鼠体重增长、升高肾脏脏器系数，高剂量组血清尿素与肌酐上升，肾损伤早期标志物 KIM-1 显著升高，HE 染色可见肾小管上皮脱落、空泡变性，Masson 染色提示肾纤维化趋势，透射电镜观察到线粒体缩小、双层膜结构模糊，同时铁死亡标志性产物 4HNE 升高，氧化应激与脂质过氧化指标异常，TUNEL 阳性细胞增多，完整证明 DON 暴露可引发小鼠肾小管结构与功能损伤，并伴随铁死亡与氧化应激的典型特征。

Figure 3 DON 暴露诱导小鼠肾小管上皮 TCMK-1 细胞发生铁死亡

本图以 TCMK-1 细胞为体外模型，结合蛋白质组学、分子检测、荧光探针与原子力显微镜成像，系统证实 DON 可诱导肾小管上皮细胞铁死亡，蛋白组学筛选出铁死亡相关蛋白显著差异表达，DON 处理后细胞 SLC3A2、FTL1 等铁代谢与氧化还原关键蛋白下调，胞内 ROS 水平上升、脂质过氧化增强，Fe²⁺大量蓄积，原子力显微镜观察到细胞膜出现不规则突起，细胞骨架肌动蛋白与微管蛋白排列紊乱、细胞膜起泡，而铁死亡抑制剂 Liproxstatin-1 可有效缓解上述损伤，明确 DON 通过干扰铁代谢、诱发脂质过氧化直接触发肾小管上皮细胞铁死亡。

Figure 4 DON 暴露导致 TCMK-1 细胞自噬流阻断与线粒体功能障碍

这张图聚焦 DON 对细胞自噬与线粒体的影响，蛋白质组学与 Western blot 结果显示 DON 上调 GABARAPL2、显著下调 ATG4B，LC3Ⅰ 大量蓄积且 LC3Ⅱ 转化受阻，GFP-mCherry-LC3B 荧光示踪发现自噬溶酶体比例降低，证明自噬流被阻断且自噬体形成存在缺陷，透射电镜观察到线粒体嵴紊乱、体积缩小、双层膜结构受损，线粒体自噬无法有效清除异常线粒体，荧光探针检测显示线粒体超氧阴离子大量生成、膜电位下降、ATP 合成受抑，线粒体外膜蛋白 TOMM20、VDAC3 表达降低，线粒体网络结构被破坏，说明 DON 通过抑制自噬体形成引发线粒体损伤，而受损线粒体又加剧氧化应激，形成损伤循环。

Figure 5 DON 暴露诱发 TCMK-1 细胞溶酶体功能障碍

该图揭示 DON 肾毒性中溶酶体的关键作用，蛋白质组学显示 DON 处理后溶酶体相关蛋白表达异常，LAMP1 升高而 LAMP2、CTSB、CTSD 等功能蛋白降低，透射电镜观察到细胞内溶酶体大量蓄积，Western blot 与 mRNA 检测进一步验证溶酶体标志蛋白与功能蛋白的异常变化，即便使用线粒体抗氧化剂 MitoTempo，也无法完全逆转 DON 导致的铁死亡、Fe²⁺蓄积与自噬流阻断，说明 DON 不仅损伤线粒体，还直接造成溶酶体功能障碍，且这种损伤不依赖线粒体氧化应激单一途径，是自噬流受阻的重要下游原因。

Figure 6 DON 暴露促使 Fe²⁺向溶酶体聚集介导溶酶体功能障碍

本图动态展示 DON 诱导 Fe²⁺蓄积与溶酶体损伤的关联，随 DON 处理时间延长，TCMK-1 细胞逐渐呈现铁死亡样形态改变，细胞膜表面结构异常，FTL1 蛋白持续降解、LAMP1 逐渐升高，溶酶体数量不断增多，荧光共定位显示 Fe²⁺与溶酶体信号高度重合，而铁螯合剂 DFO 能够有效缓解 DON 导致的 CTSB、CTSD 降低与溶酶体异常蓄积，清晰证明 DON 引发的细胞内 Fe²⁺异常升高会持续向溶酶体聚集，通过铁依赖的氧化损伤破坏溶酶体结构与功能，进而进一步阻断自噬流，是 DON 诱导肾损伤的重要分子环节。

Figure 7 DON 暴露诱导小鼠肾脏溶酶体功能障碍

该图将体外细胞结论在小鼠体内进行验证，Western blot 结果显示 DON 暴露后小鼠肾脏 LC3Ⅰ/Ⅱ 升高、ATG4B 显著降低，提示肾脏自噬启动异常，同时 LAMP1 表达上调、LAMP2、CTSB、CTSD 等溶酶体功能蛋白明显下调，免疫组化显示肾脏组织中 LAMP2 与 CTSD 阳性表达降低，且 CTSD 表达密度与血清肌酐呈显著相关，透射电镜观察到小鼠肾脏内溶酶体数量增多、结构异常，完整证实 DON 在动物体内同样会造成肾脏自噬异常与溶酶体功能障碍，且溶酶体损伤与肾小管功能损伤直接相关，进一步夯实体内机制的可靠性。

Figure 8 DON 致肾小管损伤的分子机制模式图

这张机制图高度概括全文核心通路，直观展示 DON 暴露引发肾损伤的完整恶性循环：DON 首先抑制 ATG4B 导致自噬体形成障碍，自噬流被阻断，受损线粒体无法被有效清除进而大量产生超氧阴离子，降低细胞对铁死亡的抵抗能力，同时胞内 Fe²⁺向溶酶体聚集引发溶酶体功能障碍，而溶酶体失能又进一步加剧自噬流阻断，最终共同导致肾小管上皮细胞损伤与肾功能异常，清晰阐明自噬流异常、线粒体损伤、铁死亡、溶酶体功能障碍在 DON 肾毒性中的协同作用与因果关系，提炼出全文最核心的分子机制。

研究结论

DON 暴露在体内外均会引发肾小管上皮细胞损伤，核心机制为：DON 抑制 ATG4B 导致自噬体形成障碍，自噬流受阻无法清除受损线粒体，进而引发线粒体超氧阴离子过量生成，降低细胞铁死亡抗性；同时 Fe²⁺向溶酶体聚集并诱发溶酶体功能障碍，进一步阻断自噬流，形成恶性循环。本研究明确自噬流异常是 DON 诱导肾损伤的关键环节，为 DON 肾毒性防治提供了自噬、铁死亡、溶酶体等潜在干预靶点，丰富了霉菌毒素器官毒性机制理论。

局限：仅聚焦 ATG4B 与 LC3，未深入 GABARAP 等亚型，未探究 DON 对肠 - 肾轴与 DMT1、TRPML1 通路的影响。展望：后续解析肠 - 肾轴互作机制，明确铁代谢关键通路，开发靶向自噬 / 溶酶体的防控干预手段。