干腌火腿作为传统腌腊肉制品中的典型代表，鲜红似火是其最重要的感官特性之一，在加工和销售过程中，如何保持干腌火腿良好的色泽状态一直是该领域的研究热点。在肉制品腌制过程中，常常添加硝酸盐或亚硝酸盐使肉制品长时间具备稳定良好的色泽。但过多的亚硝酸盐摄入会对人体健康造成威胁，如与仲胺生成具有强致癌性的N-亚硝胺化合物。本课题组前期研究表明，干腌火腿红色素的化学本质是锌原卟啉（ZnPP），它以Zn²⁺的形式配位于原卟啉IX（PPIX），性质稳定，能有效替代亚硝基团呈色，ZnPP的发现也为替代亚硝酸盐发色提供了更好的思路。目前，主要存在3 种形成ZnPP的途径：一是非酶反应，目前普遍认为ZnPP来源于肌红蛋白中血红素的Fe²⁺在厌氧条件下被Zn²⁺取代，O₂浓度、亚硝酸盐含量以及加热等条件会抑制该反应的进行；二是酶促反应，干腌肉制品自身内源酶的作用，例如亚铁螯合酶（FECH）在Fe²⁺含量充足下催化Fe²⁺插入PPIX，而在Fe²⁺缺乏且Zn²⁺含量充足下催化Zn²⁺插入PPIX；三是细菌诱导的酶反应，由于干腌肉制品自身的内源酶活性会在加工过程中会逐渐减弱，当干腌肉制品内源酶失活时，某些优势细菌将会参与从血红素中去除Fe²⁺和将Zn²⁺插入PPIX等过程的酶促反应。

干腌火腿中的微生物组成比较复杂，在加工成熟过程中会发生微生物群落的更新和演替。研究表明微生物能够改善产品质构，促进肉制品的特殊风味形成，改善肉制品的色泽。若对微生物加以筛选和调控，可以达到替代亚硝酸盐发色功能的目的。因此，为了提升肉制品的色泽品质，筛选具备高效ZnPP生成能力的发酵菌株尤为重要。同时，深入分析与鉴定在干腌火腿加工过程中对ZnPP形成起关键作用的优势微生物，具有重要的研究价值。

云南农业大学食品科学技术学院的陈光辉、王桂瑛*、廖国周*等选用不同成熟年份（1、2 a和3 a）宣威火腿的股二头肌（BF）和半膜肌（SM）为研究对象，通过对其色泽、理化特性、微生物群落与色素含量变化等进行分析，进一步探讨宣威火腿中细菌群落与色泽变化的潜在联系，初步确定具备潜在促进ZnPP形成能力的优势细菌，旨在为肉制品发色机制研究提供新的思路和方向，为肉制品的色泽调控与质量控制提供科学理论依据。

1 不同年份宣威火腿中BF与SM的色泽分析

不同年份火腿BF和SM色泽变化如图1所示。各组亮度（L*）值随着时间的延长而降低，其中BF组显著高于SM组（P＜0.05）。BF组的红度（a*）值随时间的延长呈升高趋势，而SM组出现先升高后降低的趋势；1 a火腿与2 a火腿BF的a*值均低于SM，而3 a火腿的BFa*值高于SM，分别为10.92与10.29，这可能是因为随着时间的延长，部分SM肌红蛋白氧化为高铁肌红蛋白，影响了肌肉的a*值。而各组b*值随着年份的增加呈先增加后低降的趋势。在1 a和2 a火腿中，SM中的黄度（b*）值高于BF，3 a火腿的BF b*值又高于SM，但差异不显著。C值被用来表示颜色的鲜艳程度，不同年份火腿BF和SM C值随时间的变化趋势与a*值一致，受a*值影响较大，1 a、2 a SM的C值组高于BF，且第2年SM中的C值显著高于BF（P＜0.05）。

2 桑葚水提物的降尿酸性活性评价

宣威火腿色素含量变化见表1，各年份BF与SM的总Fe含量无显著性差异，而SM的总Zn含量均显著高于BF（P＜0.05），各组中的总Zn含量约为总Fe含量的2 倍左右。在宣威火腿BF组中，ZnPP含量随着时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势，2 a样品的ZnPP含量最高，达到72.07 mg/kg，显著高于1 a（54.01 mg/kg）（P＜0.05）和3 a（65.63 mg/kg）（P＜0.05）的样品；而在SM中，3 a样品的ZnPP含量最高，达到70.76 mg/kg，显著高于1 a（54.76 mg/kg）（P＜0.05）和2 a（55.44 mg/kg）的样品（P＜0.05）。值得注意的是，血红素含量、PPIX含量与ZnPP含量趋势相反，当ZnPP含量出现升高的趋势时，血红素含量和PPIX含量明显降低，这进一步论证了由于血红素中Fe²⁺的解离，导致Zn²⁺与PPIX得以螯合促使了ZnPP的形成。

3 不同年份、部位宣威火腿中细菌群落多样性分析

3.1

不同年份、部位宣威火腿的细菌序列数目

采用高通量测序技术比较不同年份BF和SM宣威火腿样品的细菌群落组成差异。由表2可知，在6 个不同样品中共鉴定得到410 125 条DNA序列，序列数在不同年份的不同部位之间样品均表现出差异，其中最大原始序列数为135 415 条，最小原始序列数为40 225 条，样品平均序列长度在418 bp左右，序列长度大部分在300～500 bp之间，各样本有效序列数均在500 条以上，满足分析要求。且不同年份宣威火腿中，BF细菌的有效序列数高于SM组，且随着年份增加，二者之间的差距在逐渐减小。

3.2

不同年份、部位宣威火腿细菌OTU分析

OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于分析，人为给某一个分类单元（品系、种、属、分组等）设置的同一标志。图2显示了不同年份、部位宣威火腿样品细菌OTU分布的Venn图，它能够直观地将不同年份宣威火腿样品细菌的OTU数目组成的相似性和重合情况显现出来。不同年份宣威火腿样品共有的OTU数为202，占总OTU数的21.05%，1 a样品中，BF和SM共有的OTU数为4，2 a样品中，BF和SM共有的OTU数为68，3 a样品中，BF和SM共有的OTU数为84；3 个年份中BF和SM共有的OTU数为292，其中BF中特有的OTU数为983，SM中特有的OTU数为61；同时1、2 a和3 a宣威火腿样品特有的OTU数分别为100、332和252。由此得出随年份的延长，宣威火腿SM和BF中的细菌群落正在逐渐重合，这与其他研究结果一致。

3.3

α多样性分析

通常来说，ACE和Chao1指数用于反映样品中微生物群落的丰富度，两者数值越大，说明微生物群落相对丰富度越高，而Shannon和Simpson指数受样品中微生物群落相对丰度和均匀度的影响，用于反映样品中微生物群落的多样性，Shannon指数越大，微生物群落多样性越高，而Simpson指数越大，多样性越低。

由表3可知，同一年份条件下，BF组的ACE和Chao1指数均大于SM组，且差异显著（P＜0.05），SM组的Shannon指数低于BF组，Simpson指数高于BF组，表明BF与SM随年份延长细菌群落多样性在升高。在3 a样品中，SM的Shannon、Simpson指数低于BF，但二者差异均不显著（P＞0.05），说明在3 a样品中，SM和BF细菌相对丰度和多样性较为相似。Coverage指数用于分析样品中微生物测序覆盖率，该指数可以反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况，其数值越高，则样本中微生物被测出的概率越高。各组宣威火腿样品的Coverage指数均大于0.99，表明测序结果可以完全代表样品中的细菌群落。

3.4

 样本组间PCoA

主坐标分析（PCoA）是一种非约束性的数据降维分析方法，可以将不同样本间的差异直观反映在二维坐标图上，两样本距离越近，表示样本越相似，反之则相反。基于Bray-Curtis距离算法在OTU水平上得到不同年份、部位宣威火腿样品的PCoA图（图3），不同年份、部位干腌火腿样本PCo1和PCo2分别解释了不同年份、部位干腌火腿细菌群落55.20%和26.19%的信息，两个主成分之和为81.39%，说明该模型可以较好地解释样品中细菌群落信息，其中R值为0.818 4，表明不同年份、部位干腌火腿样品细菌群落组间差异大于组内差异；P值为0.001，表明此次检验具有显著性。3 a的BF组和SM组样品细菌群落均有交叉，表明细菌群落结构组成具有相似性。结果表明，随年份的延长，SM和BF细菌群落的相似度提高。

3.5

不同年份、部位宣威火腿细菌群落结构及相对丰度差异性分析

3.5.1不同年份、部位宣威火腿细菌群落在门水平上的物种分布

根据OTU结果，进一步研究不同年份BF组和SM组宣威火腿中的细菌群落组成。由图4可知，门水平上不同年份宣威火腿SM中检测出的相对丰度前5的细菌门依次为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）。其中，Firmicutes在1 a火腿SM中的相对丰度最高，为99.98%，在2 a火腿BF中最低，为58.28%；Proteobacteria在2 a火腿BF中的相对丰度最高，为30.69%，在1 a火腿SM中最低，为0.007%。由此可知，Firmicutes和变形菌门Proteobacteria是不同年份、部位宣威火腿的优势菌门，这与本课题组先前研究结果一致。

3.5.2 不同年份、部位宣威火腿细菌群落在属水平上的物种分布

由图5可知，属水平上不同年份宣威火腿SM鉴定出的优势细菌包括葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌（Bacillus）、盐单胞菌属（Halomonas）、肉杆菌（Halomonas）、四联球菌属（Tetragenococcus）、从毛单胞菌（Comamonas）、瘤胃杆菌（Ruminobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）等。其中，SM组的葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度大小依次为1 a火腿＞2 a火腿＞3 a火腿，相对丰度依次是99.97%、81.19%和22.99%；而BF组的葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度大小依次为3 a火腿＞2 a火腿＞1 a火腿，相对丰度依次是49.47%、31.64%和6.74%。因此，葡萄球菌属（Staphylococcus）为宣威火腿SM的优势菌属，且相对丰度随着年份的延长在SM中逐渐降低，在BF中逐渐升高。

4  宣威火腿细菌群落与色素指标相关性分析

5 ZnPP形成菌的筛选及鉴定结果

通过ZnPP形成模型系统对菌株的ZnPP形成能力进行评价，结果发现（图7），X5、X8、X13、X23 4 株菌促进ZnPP形成的能力最强，菌株X5、X8、X13、X23模拟体系的ZnPP质量浓度分别为28.53、33.68、31.65、30.73 mg/L，均显著高于CK组（6.23 mg/L）。而在添加亚硝酸盐组中，ZnPP的质量浓度只有0.12 mg/L，这可能是由于该组模拟体系中形成了更稳定的亚硝基，抑制了ZnPP的形成。将4 株ZnPP形成能力最强的菌株进行16S rDNA序列的遗传分析鉴定，结果见表4。

由表4可知，在源于宣威火腿且对ZnPP形成促进作用最强的4 株菌株中，X5被鉴定为马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum），X8被鉴定为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus），X13被鉴定为表皮葡萄球菌（S. epidermidis），X23被鉴定为副凝聚短状杆菌（Brachybacterium paraconglomeratum）。

6 发酵体系中FECH活性的分析

由图8可知，在宣威火腿发酵模型中，接种组的ZnPP含量与FECH活性均大于CK组，这说明筛选后的4 株ZnPP形成优势细菌能通过提高FECH活性的方式促进锌卟啉的形成，细菌诱导的酶促反应是ZnPP形成的重要方式[27]。在BF部位中，TH接种组的ZnPP含量最高，为66.73 mg/kg，显著高于CK组（52.61 mg/kg），同时TH组的FECH活性（53.92 U/g）也高于CK组（52.03 U/g）；而在SM部位中，BL接种组的ZnPP含量最高，为94.15 mg/kg，显著高于CK组（51.51 mg/kg），同时BL组的FECH活性（65.032 U/g）也显著高于CK组（41.34 U/g）。除BL组外，其他接种组的BF部位FECH活性高于SM部位，但ZnPP却低于SM部位，这是由于O₂会抑制FECH的活性从而导致火腿表面肌肉SM低于内部的BF；而FECH活性低却ZnPP含量更高，可能是在ZnPP的形成过程中，还有例如锌螯合酶等不受O₂影响的物质参与到ZnPP合成。

讨论

色泽是消费者评价干腌火腿品质最直接的感官指标之一，人们对食物的消费预期会因为食物本身带给我们的视觉感官刺激而发生变化，鲜艳稳定的红色更容易使消费者接受。本研究中，在1、2 a宣威火腿的BF和SM中，SM与氧气接触的面积更大，肌红蛋白转化为高铁肌红蛋白的速率更高，导致SM的b*值相较于BF更高。但随着宣威火腿贮藏到第3年，SM部分血红素中心的铁离子氧化为三价，三价血红素的增多和紫色强度提升可能是导致3 a宣威火腿SM中b*值更低的原因。但由于未加亚硝酸盐腌制的原因，宣威火腿的a*值与帕尔玛火腿差异不明显。同时，随着时间推移，L*呈降低趋势的变化，可能是宣威火腿水分含量的降低和氧化程度的增加所导致，而SM部分更多三价血红素的存在也导致SM亮度低于BF。宣威火腿1、2、3 a时b*值呈现先升高后降低的趋势，可能是由于脂质氧化产物与磷脂头部基团中的胺或蛋白质中的胺发生化学反应而产生的黄色色素，也可能是由于肌红蛋白等的分布差异对b*值产生了影响。

ZnPP是干腌火腿红色素的化学本质，是无硝干腌火腿中红色色泽的主要贡献者。随时间延长，无硝宣威火腿BF和SM中血红素含量下降时，ZnPP含量上升，反之亦然，且血红素与PPIX含量变化趋势一致。这表明ZnPP的形成可能与血红素Fe²⁺解离后，Zn²⁺与PPIX或卟啉螯合有关。然而，Bou等报道，在腌制发酵15 个月的干腌塞拉诺火腿中，BF和SM的ZnPP含量分别为67 mg/kg和31 mg/kg，与1 a宣威火腿BF和SM的ZnPP含量相比，塞拉诺火腿BF的ZnPP含量比宣威火腿BF的ZnPP含量（54.01 mg/kg）高，但宣威火腿的SM部位的ZnPP含量（54.76 mg/kg）则比塞拉诺火腿的高。就加工条件而言，宣威火腿采用分次上盐的腌制工艺，为期30 d的腌制期上盐量为5%～6%，较塞拉诺火腿15～20 d的腌制期长，含盐量也略高于塞拉诺火腿（2.5%～3%）。宣威火腿更高的上盐量调节着发酵环境的微生物组成；而塞拉诺火腿较短的腌制时间和腌制中亚硝酸盐的添加，可能是影响ZnPP形成的重要原因。在Wakamatsu等报道的结果中，1 a宣威火腿BF的ZnPP含量约是帕尔马火腿BF的1.5 倍，SM的ZnPP含量则是帕尔马火腿SM的1.4 倍；这可能是由于三者所选用的原料肉以及加工环境的差异造成ZnPP形成速率的不同，就原料而言，宣威火腿选用的当地带有乌金猪血统的黑猪加工，而帕尔玛火腿、塞拉诺火腿则选用带有杜洛克血统的白蹄猪来加工；就发酵环境而言，与宣威地区干湿季分明、温差较大、以葡萄球菌为主的发酵环境不同，意大利和西班牙独特的地中海温湿气候，造就了该地区以微球菌、霉菌和酵母菌为主的火腿发酵环境。这些都可能是造成宣威火腿和帕尔马火腿、塞拉诺火腿ZnPP含量不同的原因。

干腌火腿中的微生物群落结构对产品的色泽调控、质地变化、风味形成方面起着非常重要的作用。细菌在发酵肉制品中发挥着重要作用，本研究中，Firmicutes、Proteobacteria被确定为宣威火腿发酵过程中的优势菌门，其中Firmicutes在1～3 a宣威火腿BF和SM的细菌群落结构中丰度占比均超过50%。此外，Staphylococcus、Bacillus、Halomonas、Halomonas、Tetragenococcus等为宣威火腿的优势属，且SM和BF细菌群落的相似度随着年份的延长逐渐提高。

Staphylococcus是发酵肉制品中常见的优势微生物，对干腌火腿的品质形成具有重要贡献。Zhu Yingying等通过高通量测序发现，Staphylococcus是5 种火腿中的优势菌属，与本研究结果一致。相关性分析结果表明ZnPP含量与Staphylococcus、Tetragenococcus等菌属呈显著正相关（P＜0.05）；而细菌群落对血红素、PPIX含量的影响与ZnPP含量刚好相反，血红素、PPIX含量与Lactobacillus呈显著正相关（P＜0.05），这些结果表明Staphylococcus、Tetragenococcus可能在ZnPP的形成过程中发挥重要作用。Morita等[41]报道从帕尔马火腿中分离出来的一些Staphylococcus，如表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、沃氏葡萄球菌（S. warneri）和慢葡萄球菌（S. lentus），会产生一种红色色素，主要为ZnPP。余长金等通过综述总结了木糖葡萄球菌在发酵过程中具有较好的硝酸还原酶活性，可能通过影响该酶活性的方式减缓肌红蛋白的氧化，从而稳定肉制品色泽。这些球菌还具有还原亚硝酸盐和形成过氧化氢酶的作用，对干腌火腿的品质及色泽的形成具有促进作用，可能通过影响FECH、锌螯合酶等酶活性的方式对ZnPP形成起到一定的促进作用。也有研究表明，在无硝干腌火腿腌制发酵过程中，ZnPP的形成可能依赖于FECH活性的大小。

通过对ZnPP含量最高的2 a无硝干腌火腿BF和SM样本进行菌种分离，并建立ZnPP形成模拟体系，筛选出4 株可能通过影响酶活性促进ZnPP形成能力的细菌。同时在模拟体系中添加亚硝酸盐得到的结果与Adamsen等的报道一致，在干腌火腿中添加亚硝酸盐会显著抑制ZnPP的形成，当添加量为1%时，可以完全抑制ZnPP的形成。最后对筛选出的4 株优势菌进行鉴定，分别为马胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜盐四联球菌以及副凝聚短状杆菌。尽管从宣威火腿中筛选出的4 株优势细菌在火腿发酵模型中具有调节FECH活性从而促进ZnPP形成的能力，但关于这些细菌促进ZnPP形成的最佳条件仍需深入探究。同时，这些优势细菌诱导性酶促反应的具体机理也尚待明确。为了更全面地理解这一过程，未来的研究将聚焦于优化细菌培养条件，以及揭示细菌如何通过酶促反应促进ZnPP的生成。

作者简介

通信作者：

王桂瑛，教授，硕士研究生导师。在食品科学领域围绕“肉品加工与质量控制”方向，针对云南火腿与云南地方鸡等特色资源开展研发与社会服务工作。近年来主持和参与国家自然科学基金项目及云南省科技计划重大科技专项等11 项，在Food Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Science and Human Wellness、Food research international、Meat Science、《食品科学》等国内外学术期刊上发表学术论文50余篇，授权专利20余项，获中国畜产品加工研究会科技进步奖二等奖1 项。主持“食品原料学”国家级线上线下混合式一流课程，获云南农业大学教学成果一等奖、云南省高校教师教学大赛三等奖。

廖国周，博士，教授，博士研究生导师，中国畜产品加工研究会常务理事、云南省中青年学术和技术带头人后备人才、云南省现代农业生猪产业技术体系猪肉食品加工研究室岗位专家、云南省科技特派员、昆明市中青年学术与技术带头人及后备人选、云南农业大学“百名”青年学术和技术带头人、Food Science of Animal Products及《肉类研究》编委。近年来，主持和参与国家自然科学基金及云南省重大科技专项等项目15 项，在Food Chemistry、Food Research International、Meat Science、LWT-Food Science and Technology、《食品科学》等国内外学术期刊上发表学术论文100余篇，获授权专利22 项，申请发明专利14 项，制定行业与地方标准2 项，出版论著及教材5 部。

第一作者：

陈光辉  云南农业大学食品科学技术学院2022级硕士研究生，研究方向为肉品加工与质量控制，以第一作者发表EI 1 篇，参与发表SCI论文篇。主持科技创新创业行动基金项目3 项、参与国家重点研发计划课题项目1 项，获2025年云南省省级优秀毕业生。