最新高产!江苏大学副院长&农业农村部神农青年英才Green Chem-全细胞级联创纪录:工程大肠杆菌高效合成瑞鲍迪苷M与副产物果糖升级

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一、中文标题

高效全细胞平台用于瑞鲍迪苷M生物转化：级联设计、表达调控与过程工程（An efficient whole-cell platform for Rebaudioside M biotransformation: cascade design, expression regulation, process engineering）

二、发表单位及通讯作者

发表单位：江苏大学通讯作者：Cunshan Zhou（周存山）

三、科学问题

如何通过构建大肠杆菌全细胞催化体系，整合级联酶反应、基因表达调控与过程工程策略，实现瑞鲍迪苷M的高效生物合成，并解决辅因子成本高、副产物浪费等关键瓶颈？

四、发表时间

时间：2025年12月29日

链接：DOI https://doi.org/10.1039/D5GC04865F

五、摘要

     本研究首次构建了一个集成的大肠杆菌全细胞级联系统，共表达工程化UGT76G1变体和大豆蔗糖合酶（GmSuSy），利用蔗糖实现UDP-葡萄糖原位再生，驱动Reb-D向Reb-M转化。通过多拷贝整合、RBS工程、培养基和诱导条件优化，以及细胞透性化处理和反应条件优化，克服了过程瓶颈。采用补料分批策略，最终在200 mL体系中获得30.6 g/L Reb-M，转化率95.9%，为目前报道的最高水平之一。此外，首次将副产物果糖通过D-塔格糖3-差向异构酶模块转化为高附加值D-阿洛酮糖（2.97 g/L），提高了原子经济性和可持续性。该研究为绿色、经济的Reb-M工业化生产提供了新平台。

六、研究背景

      过量糖摄入引发的肥胖、糖尿病等慢性代谢疾病已成为全球性健康危机，推动了对零热量、可持续甜味剂的需求。瑞鲍迪苷M（Reb-M）作为来自甜叶菊的高强度甜味剂，具有蔗糖般纯净口感且无苦后味，甜度约为蔗糖的200–350倍，并兼具多种生物活性，是极具潜力的代糖产品。然而，其工业化生产面临严峻挑战：植物提取法受限于甜叶菊生长周期长、叶片中Reb-M含量极低（<0.1%干重），且提取工艺复杂，经济性差；化学合成法缺乏立体选择性，难以应用。因此，利用合成生物学构建微生物细胞工厂成为可持续替代路径。

      近年来，研究者尝试在大肠杆菌或酵母中从头合成Reb-M前体，但产量仅为毫克/升级，远未达到工业要求。相较而言，以相对丰富的糖苷（如Reb-D）为底物，通过糖基转移酶（UGT）进行体外酶法或全细胞转化更具可行性。其中，UGT76G1可催化UDP-葡萄糖（UDP-Glc）向Reb-D的C3-羟基转移生成Reb-M。然而，该路线仍存在四大瓶颈：①植物源UGT76G1在微生物中表达易形成包涵体，可溶性差；②UDP-Glc作为昂贵辅因子，需经济高效的再生体系；③现有研究多集中于酶工程改造，对整体过程优化关注不足；④糖基化反应中会释放等摩尔的果糖副产物，传统工艺未加利用，造成原子浪费。

      针对上述问题，本研究拟建立大肠杆菌全细胞催化平台，通过共表达工程化UGT76G1和蔗糖合酶（SuSy），实现UDP-Glc从蔗糖的原位再生，并系统优化基因表达、培养条件、反应参数及补料策略，最终实现Reb-M的高效合成，同时引入副产物果糖高值化模块，提升过程绿色性与经济性。

七、研究结果

结果1、全细胞平台的构建与验证

       研究选用结构指导改造的UGT76G1变体（T284S/M88L/L200A），其活性较野生型提高2.38倍。通过比较多种来源的蔗糖合酶，确定大豆来源的GmSuSy具有高可溶性表达、优良催化活性及与UGT76G1匹配的pH/温度耐受范围。将两者构建至pRSFDuet-1质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得菌株BL0。SDS-PAGE确认两蛋白成功表达（53.6 kDa和92.5 kDa），HPLC检测到Reb-M生成，证明级联系统功能完整。

图1 全细胞转化平台

结果2、UGT76G1多拷贝工程提升表达量

       粗酶液补充实验显示UGT76G1为限速步骤，因此通过增加UGT76G1基因拷贝数构建菌株BL1（2:1）和BL2（3:1）。随着拷贝数增加，UGT76G1可溶性表达分别提高17%和41%，酶活从45 U/g升至92 U/g，Reb-D转化率从42.55%升至73.63%。但GmSuSy表达因资源竞争下降，提示需平衡两酶表达。

图2 多拷贝优化

结果3、RBS工程精细调控GmSuSy表达

       为恢复GmSuSy水平，替换其核糖体结合位点（RBS）为7种不同强度的合成序列，获得菌株BL3–BL9。UGT76G1活性保持稳定（80–95 U/g），GmSuSy活性随RBS强度变化（28–78 U/g）。当两酶活性接近1:1时（BL7，RBS BBa_B0034），转化率最高达85%，较对照提高20%。RBS工程实现了翻译水平的定量调控，优化了级联平衡。

图3 RBS优化

结果4、培养与诱导条件优化提高可溶性表达

      比较6种培养基，TB培养基使Reb-M产量最高（219.55 mg/L），较LB提高4.45倍，且UGT76G1可溶性表达增加，包涵体减少。优化诱导条件：0.4 mM IPTG、16°C诱导18 h，获得最佳生物量与酶活，Reb-M产量达160 mg/L。

图4 优化培养条件

结果5、细胞透性化处理增强底物传输

       针对全细胞催化中膜传质限制，筛选多种透性化试剂。1%二甲苯处理效果最佳，Reb-M产量从2.53 mg/L升至156.86 mg/L，随后活性因细胞裂解下降。确定1%二甲苯为最优浓度，兼顾通透性与细胞完整性。

结果6、反应环境优化

       优化温度、pH、金属离子等参数：40°C时活性最高（165.98 mg/L），归因于工程酶热稳定性提升；最适pH 7.5（PBS缓冲），与GmSuSy活性窗口一致；Mn²⁺显著激活反应，6 mM时产量达189.67 mg/L。

图5 通透性和反应环境优化

结果7、过程瓶颈识别与释放

       底物溶解度：添加10% DMSO可维持4 mM Reb-D溶解>2 h，无显著细胞毒性。细胞密度：OD600=70时产量最高（258.83 mg/L）。蔗糖浓度：600 mM时达2426.6 mg/L，兼顾产量与细胞稳定性。UDP添加：0.5 mM UDP使产量提高1.35倍至4158.7 mg/L，但增量边际递减。

结果8、催化剂重复使用性

      BL7菌株在优化条件下循环使用6次，前3次活性保持>85%，6次后仍保留34%，显示良好操作稳定性。

结果9、补料分批放大生产

       在200 mL摇瓶中进行补料分批转化，每1 h补加Reb-D至4 mM，连续6轮。10 h后Reb-M产量达30.56 g/L，总转化率95.88%，时空产率3056 mg·L⁻¹·h⁻¹，为目前报道的全细胞系统最高水平，媲美纯酶级联。

结果10、副产物果糖高值化利用

        反应中累积果糖55 mM，引入D-塔格糖3-差向异构酶（DTE）粗酶液，55°C下2 h转化30%果糖为D-阿洛酮糖（16.5 mM，2.97 g/L）。首次实现Reb-M生产过程中副产物升级，提高碳效率约15%。

图6 条件优化

八、讨论

        本研究成功构建了首个集成化大肠杆菌全细胞级联平台，通过多维度工程策略（酶表达调控、透性化处理、过程优化、补料分批）实现了Reb-M的创纪录高产（30.6 g/L），并创新性将副产物果糖转化为高附加值D-阿洛酮糖，显著提升了原子经济性与绿色度。该平台契合绿色化学原则：①蔗糖驱动的UDP-Glc原位再生，避免外源辅因子添加；②免酶纯化、温和反应条件降低能耗；③催化剂可重复使用减少废弃物；④副产物资源化提升整体效益。未来需进一步强化酶热稳定性、开发更绿色的透性化方法、优化副产物模块与原途径的耦合，以推动工业化应用。本研究为高值糖苷及天然产物的绿色生物制造提供了可扩展的范式。