3.1. QQS表达增强紫花苜蓿的根系分枝与抗旱性
为探究QQS基因的功能，对QQS-E T1代转基因幼苗进行了表型分析和抗旱性测试。结果显示，与对照（CK）相比，表达QQS的植株表现出显著增强的根系分枝能力。经过14天的干旱胁迫处理后，QQS-E植株的萎蔫程度远低于CK植株，其叶片具有更高的相对含水量（RWC）和更低的电解质渗漏率，表现出更强的抗旱性。复水后，QQS-E植株能快速恢复生长，而CK植株恢复有限。这表明QQS的表达能够通过促进根系分枝，进而提高紫花苜蓿的抗旱能力（Fig. 1）。
图1. QQS增强紫花苜蓿的根系分枝和抗旱性。(A, B) 两周龄CK（非转基因）和QQS-E（转基因）幼苗的根系分枝表型及其根分枝数统计分析（n=5）。实验使用QQS-E株系2。红色箭头指示根分枝位置。标尺=1 cm。，P < 0.01（学生t检验）。(C, F) 3月龄CK和QQS-E幼苗在干旱胁迫前以及经历14天干旱胁迫并复水3天后的表型。红色箭头指示恢复良好的分枝位置。标尺=10 cm。(D, E) 干旱胁迫下测试植株叶片的相对含水量（RWC）和电解质渗漏率（n=3）。*，P < 0.05；，P < 0.01；***，P < 0.001（单因素方差分析）。误差棒代表平均值±标准差（SD）。(G) 复水后QQS-E和CK植株的根系表型。红色箭头指示根分枝位置。标尺=5 cm。
3.2. QQS与核定位转录因子MsNF-YC4互作
通过酵母双杂交（Y2H）文库筛选，鉴定出MsNF-YC4是QQS在紫花苜蓿中的一个潜在内源互作蛋白，该互作关系通过一对一的Y2H和荧光素酶互补成像（LCI）实验得到进一步证实。RT-qPCR分析表明，MsNF-YC4基因在紫花苜蓿的各个器官中均有表达，且在根部受到脱水处理的显著诱导。亚细胞定位实验显示MsNF-YC4蛋白定位于细胞核。此外，酵母系统中的转录激活分析证实，全长的MsNF-YC4蛋白具有转录激活活性，而其截短体则不具备此功能。这些结果表明，MsNF-YC4是一个响应干旱胁迫的核定位转录因子，并能与QQS蛋白直接互作（Fig. 2）。
图2. QQS与核定位转录因子MsNF-YC4互作。(A) 酵母双杂交（Y2H）分析显示QQS与MsNF-YC4之间的相互作用。SD-TL：SD/-Trp-Leu培养基；SD-THLA：SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基；SD-THLA/X-α-Gal：添加了X-α-Gal的SD-THLA培养基。(B) QQS与MsNF-YC4的体内相互作用。(C) MsNF-YC4在紫花苜蓿不同组织中的表达模式。(D) 脱水处理下紫花苜蓿根部MsNF-YC4的表达模式。***，P < 0.001（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差。(E, F) 全长（BD-MsNF-YC4-full length）及截短体（BD-MsNF-YC4-ΔN, BD-MsNF-YC4-ΔC, 和 BD-MsNF-YC4-min）MsNF-YC4编码序列在酵母系统中的转录激活分析。SD-T：SD/−Trp；SD-TH：SD/−Trp-His；SD-THA：SD/−Trp-His-Ade；SD-THA/X-α-Gal：添加了X-α-Gal的SD-THA培养基。(G) MsNF-YC4在烟草叶细胞中的亚细胞定位。Athook：核定位标记蛋白；CBL：质膜定位标记蛋白。标尺=100 µm。
3.3. MsNF-YC4增强根系分枝与抗旱性
为验证MsNF-YC4在根系发育和抗旱性中的作用，构建了过表达该基因的转基因紫花苜蓿株系（MsNF-YC4-OE）。表型分析显示，与野生型（WT）相比，MsNF-YC4-OE植株具有更庞大的根系、更长的总根长以及显著更多的根分枝和根尖数目，且该多分枝根系的表型在其T1代转基因后代中能够稳定遗传（Fig. 3）。在干旱胁迫下，MsNF-YC4-OE植株表现出更高的存活率、更高的相对含水量和更低的电解质渗漏率。此外，其离体叶片的失水速率更慢，且在PEG模拟干旱处理下气孔开度更小。这些结果有力地证明，过表达MsNF-YC4能够显著促进紫花苜蓿的根系分枝，并提高其抗旱能力（Fig. 4）。
图3. MsNF-YC4调控紫花苜蓿的根系发育。(A) MsNF-YC4-OE植株中MsNF-YC4的相对转录水平（n=3）。，P < 0.05；，P < 0.001（单因素方差分析）。(B, C) 由扦插繁殖的3月龄MsNF-YC4-OE和WT植株的根系结构。标尺分别为10 cm (B) 和 5 mm (C)。(D) MsNF-YC4-OE和WT植株的总根长（n=5）。，P < 0.01；，P < 0.001（学生t检验）。数值为平均值±标准差。(E) MsNF-YC4-OE和WT植株根分枝数的统计分析（n=6）。，P < 0.001（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差。(F) MsNF-YC4-OE和WT植株的总根尖数。星号表示经单因素方差分析确定的显著性差异（, P < 0.001）。数值为平均值±标准差。(G, H) 1月龄MsNF-YC4-OE* T1代转基因幼苗和CK植株的根系表型。红色箭头指示根分枝位置。标尺分别为5 cm (G) 和 5 mm (H)。(I) MsNF-YC4-OE植株T1代幼苗的根分枝数。T1-CK：经PCR鉴定的非转基因幼苗；T1-TG：经PCR鉴定的转基因幼苗（n=5）。*，P < 0.001（学生t检验）。数值为平均值±标准差。
图4. 过表达MsNF-YC4增强紫花苜蓿的抗旱性。(A, B) MsNF-YC4-OE和WT植株在干旱胁迫前及胁迫处理后复水3天的表型。标尺=10 cm。(C, D) 干旱胁迫前后MsNF-YC4-OE和WT紫花苜蓿叶片的相对含水量（RWC）和电解质渗漏率（n=4）。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差。(E) 干旱胁迫后复水9天，MsNF-YC4-OE和WT植株新长出的分枝。标尺=10 cm。(F) 复水9天后MsNF-YC4-OE和WT植株的根系表型。红色箭头指示新发育的根。标尺=5 cm。(G) WT和MsNF-YC4-OE植株离体叶片随时间变化的失水率（n=3）。，P < 0.05；**，P < 0.01（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差。(H) MsNF-YC4-OE和WT植株在0%或15% PEG6000中暴露1小时后的气孔表型。标尺=10 µm。(I) WT和MsNF-YC4-OE植株在0%或15% PEG6000中处理1小时后的气孔开度（n=60）。，P < 0.05；***，P < 0.001（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差。
3.4. 过表达MsNF-YC4调控脱落酸和生长素信号通路
为揭示MsNF-YC4调控根系分枝的分子机制，对MsNF-YC4-OE和WT植株的根部进行了转录组测序（RNA-Seq）。结果共鉴定出21,437个差异表达基因（DEGs）。基因本体论（GO）富集分析显示，这些DEGs显著富集在与胁迫响应和发育相关的生物学过程中，特别是脱落酸信号、生长素代谢、过氧化物清除和根形态建成等通路，其中包括54个与生长素信号通路相关的基因（Fig. 5A）。外源施加生长素（IAA）能够显著促进野生型紫花苜蓿幼苗的根系分枝，并提高其在PEG诱导的干旱胁迫下的耐受性，表现为更低的电解质渗漏率。这表明MsNF-YC4可能通过调控生长素信号通路来影响根系发育和抗旱性（Fig. 5B-D）。
图5. MsNF-YC4-OE根系的转录组分析。(A) 分配至生长素信号转导通路的差异表达基因的热图。颜色强度代表log2FC（倍数变化对数值）。(B, C) 经外源IAA处理的幼苗的植株表型和根分枝数。，P < 0.05；**，P < 0.01（单因素方差分析）。数值为平均值±标准差（n=10）。标尺=3 cm。(D) 在五种浓度的IAA中培养9天后，再用10% PEG6000处理6天的幼苗的电解质渗漏率。星号表示经单因素方差分析确定的显著性差异（, P < 0.05; ***, P < 0.001）。数值为平均值±标准差（n=10）。
3.5. MsNF-YC4激活MsARF8基因的表达
为寻找MsNF-YC4下游与生长素信号相关的靶基因，通过对差异表达基因启动子区域的分析，发现MsARF8、MsARF19、MsABP19b和MsAUX6B等基因的启动子含有NF-Y结合位点。其中，MsARF8的表达在MsNF-YC4-OE和QQS-E的根中均上调，并且其表达能被脱水处理和外源IAA诱导，其响应模式与MsNF-YC4相似（Fig. 6A-C）。酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶（Dual-LUC）报告实验进一步证实，MsNF-YC4蛋白能够直接结合到MsARF8基因的启动子区域，并激活其转录。这些证据表明，MsARF8是MsNF-YC4的一个直接下游靶基因（Fig. 6D, E）。
图6. MsNF-YC4上调MsARF8的转录。(A) 脱水处理下WT和MsNF-YC4-OE根中MsARF8的相对表达水平（n=3）。数值为平均值±标准差。，P < 0.001（单因素方差分析）。(B) CK和QQS-E根中MsARF8的相对表达水平（n=3）。数值为平均值±标准差（n=3）。，P < 0.05；，P < 0.001（单因素方差分析）。(C) 经1 mg L⁻¹ IAA处理的紫花苜蓿幼苗根颈部MsNF-YC4和MsARF8的表达模式。数值为平均值±标准差。(D) 酵母单杂交（Y1H）分析显示MsNF-YC4与MsARF8启动子的结合。SD-TL：SD/-Trp-Leu培养基；SD-TLH + 75 mmol L⁻¹ 3-AT：含75 mmol L⁻¹ 3-AT的SD-TLH培养基。图像于30°C孵育3天后拍摄。(E) 在共转化了MsNF-YC4效应子构建的烟草叶片中，对proMsARF8-LUC报告基因的瞬时激活分析（n=10）。LUC：荧光素酶。，P < 0.05（学生t检验）。
3.6. MsARF8正向调控生长素诱导的根系分枝和抗旱性
为探究MsARF8的功能，采用瞬时反义寡核苷酸（asODN）技术抑制了其在紫花苜蓿幼苗中的表达。结果显示，抑制MsARF8不仅显著降低了其自身表达水平，还消除了外源IAA对根系分枝的促进作用。在PEG模拟干旱胁迫下，抑制MsARF8的幼苗子叶褐化更为严重，电解质渗漏率显著高于对照组。这表明，MsARF8是调控紫花苜蓿根系分枝和抗旱性的一个关键正向调控因子，介导了生长素诱导的根系发育过程（Fig. 7）。
图7. MsARF8正向调控生长素诱导的根系分枝和紫花苜蓿的抗旱性。(A) 对照组和MsARF8沉默（asODN-MsARF8）幼苗在外源IAA或PEG处理下的表型。标尺=1 cm。(B) 紫花苜蓿幼苗在20 μmol L⁻¹ asODN-MsARF8溶液中浸泡后根颈部MsARF8的相对表达水平（n=3）。，P < 0.001（学生t检验）。数值为平均值±标准差。(C) 外源IAA处理下CK和asODN-MsARF8幼苗的根分枝数（n=10）。，P < 0.05（学生t检验）。(D) 经10% PEG6000处理9天后CK和asODN-MsARF8幼苗的电解质渗漏率（n=5）。*，P < 0.001（学生t检验）。数值为平均值±标准差。
研究的创新性
本研究的核心创新之处在于，系统性地阐明了一条在重要牧草紫花苜蓿中，由外源基因QQS介导，通过内源互作蛋白MsNF-YC4及其下游靶基因MsARF8，最终调控根系发育和抗旱性的完整分子通路（QQS → MsNF-YC4 → MsARF8 → 生长素信号 → 根系分枝与抗旱性）。这不仅揭示了QQS在紫花苜蓿中发挥作用的具体机制，也为通过基因工程改良作物农艺性状提供了新的理论依据和靶点。
具体体现在以下几个方面：
揭示了QQS在紫花苜蓿中的作用机制： 研究首次发现并证实，源于模式植物的QQS基因能够与紫花苜蓿的内源核转录因子MsNF-YC4发生直接的蛋白质相互作用（Fig. 2A, 2B）。这解释了QQS作为一个非转录因子，是如何通过“借力”宿主自身的调控网络来影响下游基因表达和生理过程的，这是机制上的一个关键突破。
鉴定了MsNF-YC4的核心枢纽作用： 研究不仅证明了MsNF-YC4是连接QQS与下游信号的“桥梁”，还通过过表达实验（Fig. 3, 4）和分子生物学分析，清晰地阐明了MsNF-YC4自身作为一个响应干旱胁迫的核蛋白，在促进根系分枝和提升抗旱性中扮演着关键角色。
打通了从上游互作到下游靶基因的完整通路： 研究通过转录组学分析锁定了生长素信号通路（Fig. 5A），并进一步通过酵母单杂交和双荧光素酶报告实验，证实了MsNF-YC4能够直接结合到生长素响应因子MsARF8的启动子上并激活其转录（Fig. 6D, 6E）。这成功地将上游的蛋白互作与下游具体的基因调控事件联系起来，构建了一条清晰、线性的信号链。
验证了关键下游基因的功能： 通过反义寡核苷酸（asODN）技术对MsARF8进行瞬时抑制，实验有力地证明了MsARF8是生长素诱导的根系分枝和抗旱性的正向调控因子（Fig. 7）。这不仅为整个调控通路提供了功能性闭环证据，也凸显了MsARF8作为一个潜在的育种改良靶点的重要性。
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