PBJ | 中国农业大学陈其军团队:利用GmRPS5启动子引导的CRISPR/LbCas12a系统高效构建大豆六重突变体

研究背景

大豆作为全球关键的植物蛋白与食用油来源，其遗传改良备受关注。当前，CRISPR/SpCas9技术已广泛应用于大豆的基因组操作。在已报道的稳定遗传转化案例里，近半数研究依赖CaMV 35S或其双倍体形式驱动核酸酶表达。虽然部分工作探索了如GmUbi3、GmScreamM4（GmEF1A2）等内源启动子的应用，但针对CRISPR/Cas12a这一新兴工具，其在大豆中的启动子选择仍相对局限，多集中于eFMV-AtEF1A、CaMV 35S等常规组成型调控元件。

相较于Cas9，LbCas12a（含其衍生变体）凭借其固有的核糖核酸酶活性，能够自主加工CRISPR阵列，仅需简洁的crRNA结构即可实现多位点编辑，展现出在多基因叠加改造中的突出潜力。研究团队前期在拟南芥中的工作证实，利用核糖体蛋白S5基因（RPS5）的启动子驱动改造后的低温适应性LbCas12a变体（ttLbUV2），可显著提升多靶点编辑效能。考虑到大豆育种实践中，诸如风味改良、抗营养因子消除及生育期调整等多性状聚合的现实需求，开发适配于大豆的高效LbCas12a表达体系已成为当前研究的迫切方向。

中国农业大学陈其军团队在《Plant Biotechnology Journal》发表最新成果，报道了一种适用于大豆的高效CRISPR/LbCas12a多基因编辑新策略。该策略的核心在于使用从大豆中筛选获得的强效内源启动子GmRPS5-9来驱动ttLbUV2（LbCas12a变体）的表达。实验结果显示，该启动子驱动的编辑系统具有极高的多靶点编辑能力，在T0代即可创制出六基因编辑突变体。这些突变性状能够稳定遗传至T1代，且通过后代分离，可以获得无转基因成分且目标性状（如浓郁香味）表现优异的纯合株系。该研究不仅验证了GmRPS5-9启动子的高效性，也为大豆香味改良等多性状聚合育种提供了重要的技术参考。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70588

主要研究结果

在当下的作物基因编辑研究中，CRISPR/SpCas9系统凭借其高编辑效率和便捷的操作，已成为大豆功能基因组学及育种应用的主流工具。其中，启动子的选择是影响编辑系统表现的关键变量。目前，该领域常用的调控元件包括组成型的CaMV 35S类启动子，以及来自大豆自身的GmUbi3、GmScreamM4等内源启动子。另一方面，基于LbCas12a的编辑技术也在大豆改良中崭露头角。研究团队前期在拟南芥中的工作表明，携带D156R和E795L突变并经过核定位信号优化的ttLbUV2变体，其多基因编辑能力显著优于常规版本。与此同时，RPS5启动子已在多种植物中被证实能驱动Cas蛋白实现高效表达。基于上述线索，研究团队推测：利用大豆内源的RPS5启动子来驱动ttLbUV2，或可在这一重要作物中建立更为高效的多基因编辑体系。

为检验这一设想，研究人员从栽培大豆品种“天龙1号”中分离获得了4条RPS5启动子的同源序列（依次命名为RPS5-2、-9、-12、-13）。同时，选取文献中报道表现良好的GmScreamM4与GmScreamM8作为参照启动子，分别构建至驱动ttLbUV2表达的植物表达载体中。针对编辑靶点的选择，研究聚焦于与大豆农艺品质密切相关的6个基因（BADH1、BADH2、Lox1、Lox2、Lox3及E1）。团队设计并组装了由4个crRNA组成的串联表达单元，其中crRNA的转录分别由拟南芥AtU6-26启动子与大豆内源GmU6启动子驱动。最终，共构建获得9个结构各异的CRISPR/LbCas12a编辑载体，并通过农杆菌转化途径获得了相应的转基因事件。各载体所获得的T0代独立转化株系数量介于18至66个之间，为后续系统评估各启动子的驱动效能提供了可靠的材料基础。

为评估不同启动子驱动下的编辑效率差异，团队对各转基因株系进行了系统检测。结果表明，所测试的6种启动子均能够有效驱动LbCas12a实现靶向编辑，但不同启动子之间的效率存在差异，其中GmRPS5-9与GmScreamM4表现尤为突出。

具体来看，在由GmRPS5-9驱动的pR9a载体所获得的66个T0代株系中，检测到14个株系为纯合或杂合的六基因突变体，占比21.2%；同时，发生六基因嵌合突变的株系为38个，占比57.6%。而在GmScreamM4驱动的pM4a载体获得的48个株系中，纯合/杂合六重突变体为11株，占比22.9%；六基因嵌合突变体为19株，占比39.6%。上述数据进一步印证了GmRPS5-9与GmScreamM4两种启动子在大豆多基因编辑体系中的高效驱动能力。

为深入探究不同基因型突变体的分布特征，团队对获得的高阶突变材料进行了系统分析。结果显示，在所有五重、四重等多靶点突变类型中，六重突变体的出现频率最高，表明该编辑系统对6个靶位点具有均衡的作用效率，未表现出明显的靶点偏好性，能够同步实现多基因的高效修饰。进一步的定量测序分析也佐证了这一趋势：大豆内源的GmRPS5-9启动子在整体编辑效率上略高于GmScreamM4，展现出更强的适用性，可作为CRISPR/LbCas12a系统在大豆中进行多基因编辑的可靠驱动元件。

针对crRNA转录所需的Pol III启动子，团队也开展了系统比较。在多个靶标组合（如pM4a/pM4b和pM4c/pM4d对应的6靶点体系，以及涵盖全部12个靶点的复合体系）中，AtU6-26与GmU6两种启动子驱动crRNA表达的效率无显著差异。这说明拟南芥来源的AtU6-26启动子在大豆细胞中同样具备良好的转录活性，其功能与大豆内源GmU6启动子相当，为多靶点编辑体系提供了更多可选的构建元件。

在验证突变体的遗传稳定性及表型效应方面，团队进一步对T1代材料进行了追踪分析。结果显示，部分不含T-DNA插入的纯合及双等位六重突变株系成功从后代中分离获得，证实由该CRISPR/LbCas12a系统诱导的突变可通过减数分裂稳定传递至下一代。对这些材料的表型鉴定表明，所有11个纯合及双等位突变株系的叶片中，特征香气物质2-AP含量均显著高于野生型对照，明确印证了BADH基因编辑在改良大豆风味性状中的有效性，也为该编辑系统在实际育种中的应用潜力提供了有力支持。

综合上述实验结果，本研究证实，大豆内源启动子GmRPS5-9能够高效驱动优化型LbCas12a变体（ttLbUV2）的表达，进而实现对多靶点基因的同步精准编辑。该技术体系不仅显著提升了大豆多基因编辑的效率，有效规避了靶点偏向性问题，也为复杂农艺性状的分子育种、多基因调控机制的深度解析以及重要功能基因的联合研究，提供了一套高效可靠的技术支撑。

END

2025级硕士研究生

杨培宇