JAFC | 上海市农业科学院朱红芳团队揭示DNA高甲基化对不结球白菜耐热性的正调节作用机制

温度是影响植物生长发育的关键环境因子，热胁迫可导致光合抑制、叶片衰老甚至植株死亡。在全球气候变暖背景下，解析植物耐热机制具有重要理论与应用价值。研究表明，DNA甲基化可通过调控启动子活性影响胁迫相关基因表达。尽管在拟南芥、棉花、甘蓝等物种中已有相关发现，但作为喜凉叶菜作物的不结球白菜（NHCC）对热胁迫高度敏感，其耐热性的表观遗传调控机制仍不清楚。因此，揭示DNA甲基化在NHCC热胁迫响应中的作用，对理解其耐热机理及分子育种具有重要意义。

2026年1月7日，上海市农业科学院朱红芳团队联合上海交通大学方玉达教授在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表题为“Integrative Analysis of DNA Methylome and Transcriptome Reveals the Mechanism of Heat Tolerance in Non-heading Chinese Cabbage”的研究论文，研究通过整合分析热胁迫下NHCC的DNA甲基化组和转录组数据，揭示了DNA高甲基化在NHCC耐热性调控中的正向作用。

研究首先对2月龄的NHCC进行42℃、24h热胁迫处理，发现其叶片严重萎蔫（图1A）。生理指标显示，热胁迫显著促进叶绿素降解、降低光系统II最大光化学效率（Fv/Fm），并加速叶片失水（图1B–E），表明高温显著抑制NHCC的光合能力和水分保持，对其生长发育造成明显不利影响。

图1. 热应激处理破坏了NHCC的表型形态

为揭示热胁迫影响NHCC的分子机制，研究对对照组与热胁迫处理组叶片进行RNA-seq分析。PCA和皮尔逊相关性分析显示样本重复性良好。以|log2FC| ≥ 2且P < 0.01为阈值，共鉴定出4728个差异表达基因（DEGs），其中2707个下调，2021个上调。GO富集分析表明，这些DEGs显著富集于热胁迫响应、非生物胁迫应答、温度感知、激素信号转导、水分缺失响应及初级代谢等通路，说明热胁迫通过大规模重编程转录组，干扰关键生理过程，进而引发NHCC的表型损伤。

图2. NHCC热胁迫诱导转录组分析

为深入解析DNA甲基化在NHCC热胁迫响应中的作用机制，研究采用WGBS进行分析。PCA显示样本重复性良好；全基因组特征表明，DNA甲基化水平与基因密度呈负相关，而与转座元件（TE）覆盖率呈正相关。热胁迫显著提升CHH甲基化水平，尤其在转录起始位点（TSS）上游2 kb的启动子区域增幅最为明显。此外，在占基因组约50%的TE区域，热胁迫主要诱导CHG和CHH甲基化变化。这些结果提示，启动子区CHH甲基化的动态调控可能在NHCC热胁迫适应中发挥关键作用。

图3. NHCC热应激对基因组甲基化影响的分析

为验证DNA甲基化在NHCC耐热性中的功能，研究采用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-Aza）处理植株。结果显示，5-Aza显著降低全基因组CG、CHG和CHH序列的甲基化水平；经热胁迫后，处理组植株表现出更严重的叶片萎蔫和热损伤，且损伤程度随5-Aza浓度升高而加剧。生理指标显示，5-Aza处理显著降低光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）、加速叶绿素降解并减少叶片鲜重。这些结果表明，DNA甲基化在NHCC热胁迫响应中发挥保护性调控作用，其水平下降会显著削弱植株耐热性。

图4. 检验5-Aza处理对NHCC耐热性的影响

为探究DNA甲基化对基因表达的调控作用，研究基于TPM值将NHCC全基因组基因分为四组进行分析。结果显示，在CG、CHG和CHH三种序列背景下，DNA甲基化水平均与基因表达呈显著负相关：转录沉默或低表达基因（0 ≤ TPM < 1）的甲基化水平最高。进一步分析基因本体及其侧翼区域发现，尽管高、低表达基因间甲基化差异有限，但沉默基因在所有序列背景下均呈现最强甲基化信号。对基因区及启动子区的统计分析再次证实，甲基化程度越高，转录活性越低。上述结果表明，DNA甲基化在NHCC中主要发挥转录抑制作用。

图5. DNA甲基化与基因表达的关系分析

为解析热胁迫下DNA甲基化与基因表达的关联，研究鉴定出58457个差异甲基化区域（DMRs），其中CG和CHH类型的甲基化变化最为显著，且主要富集于启动子区。GO分析显示，不同序列背景（CG、CHG、CHH）的DMRs关联的功能通路各异；尤其值得注意的是，启动子区发生甲基化变化的DEGs显著富集于刺激响应和胁迫响应通路，而基因体甲基化相关的DEGs则多参与DNA复制与转运过程。基于此，研究进一步整合启动子高甲基化的差异甲基化基因（hyper-DMGs）与热胁迫下被抑制的DEGs，筛选出一批可能负调控NHCC耐热性的候选因子，为后续功能验证提供关键靶点。

图6. 热应激调节的DMGs和DEGs的综合分析

为验证候选基因在NHCC耐热性中的功能，研究结合甲基化与表达分析发现，IQD21、SMR1、PCR2和PMEI3启动子区CHH甲基化水平在热胁迫下显著升高，且其转录被强烈抑制。通过VIGS沉默实验表明，沉默IQD21、SMR1或PCR2可增强植株耐热性，表现为地上部生物量和/或光化学效率提升；而PMEI3沉默无显著效应。进一步比较耐热品种夏龙18号（XL18）与敏感品种苏州青（SZQ）发现，XL18在热胁迫下不仅表型更优，且IQD21、SMR1和PCR2的转录抑制更迅速、更显著。这些结果表明，这三个基因作为热胁迫负调控因子，其表达水平与NHCC耐热性呈负相关。

图7. NHCC热应激时下调的超DMGs热调节功能的检验

综上，这项研究揭示了DNA甲基化在NHCC适应热应激中的重要作用。热应激通过增加某些负调控热应激基因启动子区域的CHH甲基化，抑制其表达，从而提高NHCC的热耐受性。这些发现不仅揭示了NHCC应对热应激的分子机制，还为未来培育耐热性NHCC品种提供了重要的科学信息。