南京林业大学IJBM速递:美国白蛾高效治理的潜在靶标——蜕皮激素受体 B1 /超气门蛋白 1 介导的蜕皮类固醇信号调节生长发育

题目：Ecdysone receptor B1 isoform/ultraspiracle protein 1-mediated ecdysteroid signaling regulates the growth and development: potential targets for efficient Hyphantria cunea management

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

影响因子及中科院分区：8.5/二区TOP

发表日期：2025年11月8日

DOI：10.1016/j.ijbiomac.2025.148594

第一作者：乔恒

通讯作者：谭永安、郝德君

作者单位：南京林业大学、江苏省农科院、德州农工大学

美国白蛾 (Hyphantria cunea) 是一种重要的全球性检疫害虫，对林业资源造成巨大的经济损失。化学农药仍是其主要控制手段，但长期使用会导致抗性发展、环境污染和生物多样性破坏。本研究证明，EcR/USP 介导的蜕皮激素信号对美国白蛾的生长发育具有关键调节作用。敲低 HcEcR-B1（2 µg dsRNA 下沉默效率为 66.36%）使雌性蛹重显著降低 24%；而敲低 HcUSP-1（沉默效率 59.78%）使化蛹率降低 23.33%，蛹畸形率增加 11.72%。同时沉默这两个基因会产生协同效应，导致化蛹率降低 35.55%，幼虫死亡率增加至 28.89%。在机制上，联合沉默下调了几丁质酶基因（HcCht5 和 HcCDA1 表达量分别降低 4.2 倍和 3.8 倍），并使中肠几丁质酶活性降低 20.31%。利用细菌表达系统和三种纳米载体，我们构建了一种口服 dsRNA 递送系统，显著提高了 RNAi 效率。其中，壳聚糖-三聚磷酸钠 (CS-TPP) 纳米颗粒表现出最佳性能：能保护 dsRNA 免受降解（pH 2-11），增强血淋巴递送（30分钟时比裸露 dsRNA 高 2.55 倍），并在饲喂 5 天后诱导 3 龄幼虫产生 60.67% 的死亡率。这种最有效的 CS-TPP 介导递送系统为美国白蛾的新型绿色防控提供了一种有前景的生物农药 。

（一）靶标基因的鉴定与表达谱

1. 基因克隆: 克隆了美国白蛾的 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 基因，序列分析显示它们具有典型的核受体特征（DNA结合结构域和配体结合结构域）。

2. 表达模式:

发育阶段: HcEcR-B1 在化蛹阶段表达量最高；两者在五龄幼虫期均呈现“先降后升”的趋势，在蜕皮前达到峰值。

组织分布: 两者均在表皮中的表达量最高，其次是马氏管和中肠，表明它们在蜕皮过程中起关键作用。

激素诱导: 注射 20E（20-羟基蜕皮酮）24小时后，两者的表达量分别显著上调了 2.57 倍和 2.47 倍。

图2. 美国白蛾和不同目昆虫的 EcR 和 USP 氨基酸序列的系统发育分析。分支上的数值代表自展值（self-spread value），标尺指示遗传距离。

图3. 美国白蛾中 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 的表达谱。不同发育阶段 HcEcR-B1 (a) 和 HcUSP-1 (b) 的表达谱。不同组织中 HcEcR-B1 (c) 和 HcUSP-1 (d) 的表达谱。HcEF1α 被用作内参。数据以三个独立生物学重复的平均值 ± 标准误 (mean ± standard error) 表示。HE：头部；SG：丝腺；MT：马氏管；MG：中肠；FB：脂肪体；EP：表皮。柱状图上的不同小写字母表示不同样本间存在显著差异 (P < 0.05，Tukey’s test；n = 3)。(a)、(b) 和 (d) 采用 2^-ΔΔCt 取 Log2 后作图，(c) 采用 2^-ΔΔCt 作图。

（二）注射RNAi进行靶标基因功能验证

1. 表型影响:

单基因沉默: 敲低 HcEcR-B1 导致雌性蛹重显著减轻；敲低 HcUSP-1 导致化蛹率下降和畸形蛹增加。

协同沉默: 同时注射两种 dsRNA 导致化蛹率大幅下降（降低 35.55%），幼虫死亡率升至 28.89%，且畸形蛹无法完成蜕皮。

2. 分子机制:

20E通路: 沉默 HcEcR-B1 或 HcUSP-1 均显著下调了下游基因 HcE74, HcE75, Hcb-FTZ 的表达，证明它们是 20E 信号通路的上游激活因子 。

几丁质代谢:沉默这两个基因显著降低了几丁质酶基因 (HcCht5) 和几丁质脱乙酰酶基因 (HcCDA1) 的表达，并导致中肠和表皮的几丁质酶活性下降约 12%-22%。

图4. 沉默 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 对美国白蛾生长发育的影响。(a) 敲低 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 基因后美国白蛾的发育历期。 (b) 不同 RNAi 处理下美国白蛾幼虫的生存曲线。不同处理间的差异用星号表示 (***: P < 0.001; **: P < 0.01; ns: 无显著差异)。 (c) 不同 RNAi 处理下美国白蛾的蛹重。图中数据为平均值 ± 标准误，误差棒上的不同字母代表在 P < 0.05 水平下的单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和 Tukey 多重比较检验中的显著差异。 (d) 美国白蛾的化蛹率、化蛹畸形率和 (e) 蛹的异常表型。不同大写字母表示不同处理间的化蛹率差异显著 (P < 0.05)，不同小写字母表示不同处理间的化蛹畸形率差异显著 (P < 0.05)。

图5. 敲低 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 对美国白蛾中 20E 信号通路基因和几丁质合成的影响。(a–f) 通过 qRT-PCR 检测 HcE74 (a)、HcHR3 (b)、HcE75 (c)、Hcβ-FTZ (d)、HcCht5 (e) 和 HcCDA1 (f) 的转录水平。 (g, h) 敲低 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 对中肠 (g) 和表皮 (h) 中几丁质酶活性的影响。处理组与对照组之间的显著差异通过 Student’s t-test 分析 (**: P < 0.01; *: P < 0.05; ns: 无显著差异)。

（三）纳米载体口服递送系统的构建与表征

低成本合成: 利用 E. coli HT115 细菌表达系统大量合成 dsRNA，降低成本。

载体筛选: 制备了三种纳米复合物：壳聚糖 (CS)、壳聚糖-聚乙二醇 (CS-PEG) 和壳聚糖-三聚磷酸钠 (CS-TPP)。

物理表征：三种复合物均呈球形或椭球形；CS-TPP 颗粒大小均一 (201.67 nm)，Zeta 电位最高 (+26.5 mV)，有利于细胞膜吸附和摄取。

图6. CS/dsRNA、CS-PEG/dsRNA 和 CS-TPP/dsRNA 复合物的表征。(a-c) 通过琼脂糖凝胶电泳验证 CS/dsRNA (a)、CS-PEG/dsRNA (b) 和 CS-TPP/dsRNA (c) 复合物的形成。负载纳米载体的 dsRNA 不发生迁移，并在加样孔中可见荧光（由黑色箭头指示）。(d-f) CS/dsRNA、CS-PEG/dsRNA 和 CS-TPP/dsRNA 复合物的 AFM 图像，(g-i) 粒径和 (j-l) Zeta 电位。所有测量均在室温下进行三次重复，数据表示为平均值 ± 标准误。

（四）纳米复合物稳定性与生物测定

1. 稳定性:

抗降解: 裸露的 dsRNA 在肠道液和 RNase A 中易降解，但纳米载体包裹的 dsRNA 保持稳定。

pH 稳定性: 三种纳米复合物在 pH 2-11 范围内均保持稳定，适应鳞翅目昆虫碱性肠道环境。

2. 体内递送效率:

喂食 30 分钟后，CS-TPP 介导的 dsRNA 在血淋巴中的含量最高（是裸露 dsRNA 的 2.55 倍），且能持续检测长达 12 小时。

3. 杀虫活性

对 3 龄幼虫连续饲喂 5 天：CS-TPP/dsHcUSP-1 处理组的死亡率最高，达到 60.67%，显著高于 CS (17.33%) 和 CS-PEG (42%) 处理组。该系统对 4 龄和 5 龄幼虫也表现出显著的致死效果。

图7. 纳米载体负载 dsRNA 的稳定性及递送效率的增强。(a–c) 在有或无中肠内容物情况下的 CS/dsRNA (a)、CS-PEG/dsRNA (b) 和 CS-TPP/dsRNA (c) 复合物条带。M：DNA marker。 (d–f) 纳米载体负载 dsRNA 在不同 pH 环境下的稳定性。CS/dsRNA (d)、CS-PEG/dsRNA (e) 和 CS-TPP/dsRNA (f) 复合物分别在 pH 2–13 环境下室温孵育 30 min。M：DNA marker。 (g) 通过已知 dsGFP 量的连续稀释构建 dsGFP 定量标准曲线。Ct 值对应 Lg 处理后 100 µL 样品中的 dsGFP 含量 (pg)。构建线性回归模型分析数据 (dsGFP, y = -3.6371x + 29.39, R² = 0.9902)。 (h) 饲喂不同 nanocarriers/dsGFP 后美国白蛾血淋巴中 dsRNA 含量的动态变化。 (i) 横切面示意图。 (j) 饲喂 CS/dsRNA、CS-PEG/dsRNA 和 CS-TPP/dsRNA 复合物的美国白蛾幼虫荧光照片。

图8. 口服饲喂 CS/dsHcUSP-1、CS-PEG/dsHcUSP-1 和 CS-TPP/dsHcUSP-1 复合物的生物活性。(a, d) 不同剂量 CS/dsHcUSP-1 在 3 龄 (a) 和 4 龄幼虫 (d) 中的 RNAi 效率。 (a’, d’) 不同时间点 CS/dsHcUSP-1 在 3 龄 (a’) 和 4 龄幼虫 (d’) 中的 RNAi 效率。(a”, d”) 重复口服饲喂 CS/dsHcUSP-1 在 3 龄 (a”) 和 4 龄幼虫 (d”) 中的 RNAi 效率。(b, e) 不同剂量 CS-PEG/dsHcUSP-1 在 3 龄 (b) 和 4 龄幼虫 (e) 中的 RNAi 效率。 (b’, e’) 不同时间点 CS-PEG/dsHcUSP-1 在 3 龄 (b’) 和 4 龄幼虫 (e’) 中的 RNAi 效率。(b”, e”) 重复口服饲喂 CS-PEG/dsHcUSP-1 在 3 龄 (b”) 和 4 龄幼虫 (e”) 中的 RNAi 效率。(c, f) 不同剂量 CS-TPP/dsHcUSP-1 在 3 龄 (c) 和 4 龄幼虫 (f) 中的 RNAi 效率。(c’, f’) 不同时间点 CS-TPP/dsHcUSP-1 在 3 龄 (c’) 和 4 龄幼虫 (f’) 中的 RNAi 效率。(c”, f”) 重复口服饲喂 CS-TPP/dsHcUSP-1 在 3 龄 (c”) 和 4 龄幼虫 (f”) 中的 RNAi 效率。 橙色柱：dsGFP（对照）；绿色柱：dsHcUSP-1。CS/dsRNA (g)、CS-PEG/dsRNA (h) 和 CS-TPP/dsRNA (i) 复合物处理下 H. cunea 幼虫的生存曲线。不同处理间的差异用星号表示 (***: P < 0.001; **: P < 0.01; *: P < 0.05; ns: 无显著差异)。

本研究阐明了 HcEcR-B1 和 HcUSP-1 在美国白蛾生长发育中的关键调节作用。HcEcR-B1 主要影响蛹重，而 HcUSP-1 对正常化蛹至关重要 。两者共同沉默会通过下调几丁质酶基因表达和酶活性来破坏几丁质代谢。为解决 RNAi 在实际应用中的瓶颈，研究开发了一种结合细菌表达 dsRNA 和纳米载体的口服递送系统。其中，CS-TPP 纳米颗粒因其优异的保护作用（耐受宽 pH 范围）和高效的血淋巴递送能力，成为最佳载体 。该系统在 3 龄幼虫中实现了 60.67% 的死亡率，验证了 CS-TPP 介导的 RNAi 是一种针对美国白蛾的高效、绿色防控新策略 。