南京林业大学赵志峰副教授:蛋白胨对微生物诱导碳酸钙沉积的影响

微生物诱导碳酸钙沉积(MICP)技术目前在土木工程领域得到广泛研究与应用。产脲酶菌的培养是MICP技术成功应用的前提,但目前缺少关于蛋白胨配方和纯度方面的研究。本研究选用的巴氏芽孢杆菌培养基中包含胰蛋白胨和大豆蛋白胨。首先在蛋白胨用量不变的前提下,研究蛋白胨的配方和纯度对菌液浓度、活性和碳酸钙生成量的影响; 然后采用MICP注浆法加固粉土,研究蛋白胨配方和纯度对加固效果的影响。溶液试验表明,纯胰蛋白胨组的培养效果相对较差,大豆蛋白胨的加入有利于微生物的培养和脲酶活性提高。相对于高纯度蛋白胨,使用低纯度蛋白胨生成的碳酸钙更多。粉土试验结果发现,蛋白胨配方对土体加固效果存在明显影响。当胰蛋白胨和大豆蛋白胨的质量比为1:1时,试样的碳酸钙生成量和加固强度均较高; 而且低纯度蛋白胨组获得的加固强度更高。采用低纯度等比例蛋白胨配方时,蛋白胨总用量过高或过低均会导致加固强度下降,当蛋白胨总用量为15 g/L时的效果最好。因此,在MICP的产脲酶菌培养中,采用低纯度蛋白胨替代高纯度蛋白胨完全可行且有利于大幅度降低成本。

Whiffin在2007年提出MICP是很有前途的新型生物技术,将其应用于胶结松散砂土并取得了很好的加固效果。

由于该技术符合绿色环保的发展理念,适用领域广,受到了国内外学者的重视。经过大量的试验研究,MICP已被成功应用于地基加固、防风固砂、地基液化处理、文物修复、混凝土自修复等领域。

目前,常用的产脲酶菌包括巴氏芽孢杆菌、巴氏八叠球菌等。巴氏芽孢杆菌由于高脲酶活性、良好的环境适应性和吸附钙离子能力,被国内外学者广泛选用。微生物生长所需的营养要素主要包括碳源、氮源、无机盐、水以及生长因子。

虽然对于巴氏芽孢杆菌培养基并没有强制性统一要求,但经过大量实践,当前采用的微生物培养基主要有两种:美国菌种保藏中心(ATCC)推荐的NH₄-YE培养基和德国菌种保藏中心(DSMZ)推荐的蛋白胨培养基。NH₄-YE培养基成分包括:20 g/L酵母提取物、10 g/L(NH₄)₂SO₄和0.13 mol/L Tris缓冲剂。蛋白胨培养基配方包括:15 g/L胰蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠、20 g/L尿素。

培养基会影响微生物的脲酶活性和后续的碳酸钙沉积,而且是MICP成本的主要组成部分。

·Al-Thawadi等改变了培养基中酵母提取物的浓度,并通过添加镍离子提高了微生物反应效率。

·Omoregie等利用廉价的食品级酵母培养基培养出的微生物脲酶活性和碳酸钙沉淀量与高纯度培养基相接近,但微生物培养成本可降低95%以上。

·Cheng等研究了奶粉和活性污泥替代实验室级培养基的可行性,认为廉价培养基是替代昂贵培养基的潜在选择。

目前,关于培养基成分和影响的文献较少,蛋白胨占培养基成本的70%以上,但缺乏蛋白胨配方对MICP影响的研究,杂质(纯度)对微生物生长以及MICP加固的影响尚不得而知。

基于以上背景,开展培养基中蛋白胨成分和纯度对于巴氏芽孢杆菌生长影响的研究,并在此基础上研究蛋白胨对MICP加固粉土的影响。

1.1培养基

试验用巴氏芽孢杆菌(Sporosarcina pasteurii)购于德国菌种保藏中心(DSMZ)。DSMZ推荐的培养基配方:15 g/L胰蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠、20 g/L尿素。培养基中包含两种蛋白胨:胰蛋白胨含有丰富的氮源、氨基酸等,是微生物培养基关键原材料之一; 大豆蛋白胨属于复合营养物质,含有多种单糖、多聚糖及氨基酸、矿物质、维生素等营养物质。本次试验尝试高、低两种纯度的蛋白胨,高纯度蛋白胨购自北京某生物技术公司,低纯度蛋白胨购自北京某科技公司。两种蛋白胨杂质含量等参数见表1。

本试验主要探讨蛋白胨的组成和纯度对微生物生长的影响,培养基中其余成分保持不变,即每份培养基中均含有20 g尿素、5 g氯化钠、1 000 mL纯水。1 000 mL培养液中蛋白胨的总量保持为20 g,改变胰蛋白胨和大豆蛋白胨的比例,共分为10组,具体如表2所示。

1.2菌液的制备

菌液通过L550型自动平衡离心机在常温、4 000 r/min条件下离心20 min,将离心后的菌液放入生物安全柜。将上清液分离后使用移液枪吸取沉淀于离心管底部的细菌细胞,然后将其导入盛有培养液的锥形瓶中,进行重新悬浮。将锥形瓶放入培养箱中(温度30 ℃、转速130 r/min)进行培养。菌液浓度用波长600 nm的分光光度计吸光值OD₆₀₀表示。尿素水解量与溶液电导率的变化量成正比,通过电导率来确定脲酶活性。

1.3蛋白胨对微生物生长的影响

将初始OD₆₀₀值为1.44的50 mL菌种接种到400 mL培养基中,研究蛋白胨成分、纯度对菌液OD值、活性和pH的影响。

采用高纯度蛋白胨时,巴氏芽孢杆菌在不同时期的生长速度均会随着大豆蛋白胨含量的增多而逐渐上升(图1a)。当全部采用胰蛋白胨时(IH1),OD₆₀₀在48 h达到1.64。菌液OD值随着大豆蛋白胨的增多而增大。使用纯大豆蛋白胨培养基(IH5)的OD₆₀₀在48 h为2.48,是纯胰蛋白胨组的1.5倍。

采用低纯度蛋白胨时,不同组的菌液生长曲线比较相似。菌液在不同时间段的生长速率未随着大豆蛋白胨含量的增多而显著上升(图1b)。48 h后5组菌液的OD₆₀₀值分别为2.47,2.45,2.41,2.39和2.42。低纯度蛋白胨培养基的OD值与高纯度时的最优配方IH5比较接近。

各组的脲酶活性在0～12 h内快速上升,加入大豆蛋白胨的脲酶活性始终保持在较高水平(图2a)。培养48 h后纯胰蛋白胨组IH1的脲酶活性仅有3.11 mmol/(L·min),加入大豆蛋白胨IH2～IH5的脲酶活性为9.11～10.72 mmol/(L·min)。

与高纯度蛋白胨组有所不同,低纯度蛋白胨的配比对微生物脲酶活性的影响较小(图2b),IL1～IL5的脲酶活性为8.44～9.11 mmol/(L·min),IL2组的脲酶活性最高,其次为IL3和IL4。

从图3可看出,蛋白胨的组成和纯度对菌液pH的影响很小,4 h后各组pH均达到适合巴氏芽孢杆菌生长的pH 9.3,此结果与Omoregie等在相同试验条件下得到的培养基pH(9.2～9.3)相接近。

1.4溶液环境下蛋白胨对生成碳酸钙的影响

为研究蛋白胨成分和纯度对MICP的影响,先根据表2的不同配比培养菌液。将生长时间为6～48 h时的菌液(5 mL)与胶结液(45 mL)混合,在30 ℃恒温箱中反应100 min。胶结液由1.0 mol/L的氯化钙和尿素配置而成。为避免误差,将反应后的溶液进行紫外线灭菌后离心、过滤并烘干,称取碳酸钙质量。试验时设置了平行试样,选取两组试样的平均值。

各组CaCO₃生成量随着菌液生长时间总体呈上升趋势(图4a),这是由于微生物数量和活性随时间不断增加。在6～24 h范围内,低纯度蛋白胨培养基中各组碳酸钙生成量不断增加,在24～48 h碳酸钙先下降后回升。

由图4可知,碳酸钙生成量有一定波动,除测量误差外,采用的菌液体积少,导致生成的碳酸钙少也是原因之一。此外,菌液与胶结液100 min的反应时间可能不足。为进一步研究,选择高纯度组IH1、IH3、IH5和低纯度组IL1、IL3、IL5培养菌液24 h,将50 mL菌液按照1:4的比例加入胶结液,待反应3,6,12,24 h后称取碳酸钙质量。

随着反应时间的延长,碳酸钙的生成量不断增加,12 h后基本稳定(图5)。3组低纯度蛋白胨生成的碳酸钙接近,且多于高纯度组。采用高纯度蛋白胨时,蛋白胨的组成对碳酸钙生成量有影响。纯胰蛋白胨组IH1生成的碳酸钙明显低于其他组。

从以上试验结果可以看出,蛋白胨的组成和纯度对微生物的生长和溶液环境下碳酸钙的沉积均产生影响。土体环境比溶液环境更复杂、不确定因素更多,接下来研究蛋白胨对MICP加固粉土的影响。

2.1试验粉土物理特性

粉土取自江苏省盐城市东台条子泥地区并已积累较多研究成果。根据级配试验(图6),粉粒约占70%,黏粒含量低于3%,不均匀系数C_u=1.97,曲率系数C_c=1.12。根据GB/T 50123—2019《土工试验方法标准》测得该土的基本物理指标如下:干密度ρ_d=1.46 g/cm³,孔隙比e=0.84,塑限w_p=14%,液限w_L=21.8%。

2.2菌液与胶结液

菌液与胶结液的培养和配置与溶液试验相同,菌液采用高、低纯度各3种培养基配方进行培养,即IH1、IH3、IH5组和IL1、IL3、IL5组。胶结液由1.0 mol/L的等浓度氯化钙和尿素组成。

2.3试样制备

模具为内径30 mm、高120 mm的PVC管,土样高度控制在80 mm。将烘干粉土分3次装入模具,分层击实至干密度1.46 g/cm³。采用注浆法进行土体加固,菌液及胶结液通过蠕动泵从下往上注入试样,试验装置如图7。

MICP处理步骤:①首先注入2倍孔隙体积去离子水,冲刷试样内部杂质; ②注入2倍孔隙体积菌液; ③静置12 h使细菌充分吸附于土颗粒,然后注入1.5倍孔隙体积胶结液; ④间隔12 h后注入下一轮胶结液,胶结液共注入4轮; ⑤最后一轮胶结液注入24 h后,注入过量去离子水去除未反应的盐分和杂质。将处理完成的试样拆样取出,然后放在烘箱中烘干。通过无侧限抗压强度试验评价加固强度,试验前将试样顶部与底部磨平,加载速率控制为1 mm/min。强度测试后收集试样,通过酸洗法量测处理前后的质量变化Δm,然后除以初始质量m₀,得到碳酸钙百分比。

2.4试验结果

2.4.1 无侧限抗压强度测试

从强度测试中试样的破坏形态(图8)可看出,IH1的加固效果最差,仅有下部约30%的高度基本完整。IH3、IH5、IL1、IL3、IL5的破坏模式均呈现中上部破坏的特点。由于注浆方向是自下而上,土颗粒的过滤作用使到达试样上部的反应物质相对较少,因此,试样上部碳酸钙的生成较少,强度测试时最薄弱的位置先发生断裂。

经过MICP处理加固粉土后,所有试样均呈现脆性破坏特征式,除I1外的试样轴向应变ε均在1.2%～1.8%(图9)。低纯度组的IL3试样曲线斜率显著大于其他试样,说明刚度更高。其余试样的应力-应变曲线形态比较接近,高纯度组中IH5试样的刚度相对较高。

2.4.2 碳酸钙生成与加固强度

各试样的碳酸钙百分比如图10所示。由图10可知,各组试验反应生成的碳酸钙含量相差不大。高纯度组IH3、IH5和低纯度组IL3、IL5的碳酸钙百分比相对较高,超过9%。

虽然各组试样生成的碳酸钙含量相差不大,但加固强度有明显差别(图10)。IH1的强度最低不足400 kPa,IL1仅有414 kPa。IH3和IL3的强度则达到1 001和1 068 kPa,而且低纯度组的强度更高。对比表明,当蛋白胨总量不变时,胰蛋白胨和大豆蛋白胨1:1配方试样的碳酸钙生成量和加固强度均较高。

3.1试验方案

根据上述试验结果,采用低纯度胰蛋白胨与大豆蛋白胨质量比1:1组成的培养基能取得良好加固效果。因此,选取低纯度等比例蛋白胨配方,改变蛋白胨用量(表3)并研究对粉土加固的影响。

3.2试验结果

从各试样的碳酸钙生成情况(图11)可看出,各试样生成的碳酸钙含量相差不大,总蛋白胨用量较少的M1和M2试样中的碳酸钙百分比相对较高,M2试样达到11.7%。

与碳酸钙百分比不同,4个试样的无侧限抗压强度峰值有较大差别(图11)。M1的强度最低,为801 kPa; M2的强度最高,达到1 156 kPa。M3和M4试样的强度略低于M2,分别为1 048和982 kPa。无侧限抗压强度测试后,M1试样仅有下部保持完整,也说明加固效果不理想。其余3个试样呈现出整体劈裂破坏的特征,表明胶结程度较高。

选取加固强度较高的M2和M3试样进行SEM测试,结果见图12。MICP处理后,颗粒之间和颗粒表面均沉积生成了大量的碳酸钙晶体,晶体的形状以立方体为主,大小不超过10 μm,呈现出层叠生长特征。这表明采用低纯度蛋白胨培养的微生物具有较强的分解尿素能力,能够诱导生成大量以方解石晶型为主的碳酸钙,达到较好的胶结加固效果。

以上结果表明,培养产脲酶菌时用低纯度蛋白胨替代高纯度蛋白胨是完全可行的,加固粉土可取得良好效果。胰蛋白胨和大豆蛋白胨质量比1:1等比例配方的加固效果更好。目前,培养基约占MICP总成本的50%。改进前,采用DSMZ推荐配方的蛋白胨培养基成本约为4.2元/L; 而蛋白胨总用量分别为15和20 g/L的M2与M3配方成本可降至 1.5 和2.0元/L,潜在的经济效益十分显著。

在微生物诱导碳酸钙过程中,蛋白质等有机大分子对矿物的成核和生长起重要的调控作用。当有机物含量高时,有机大分子相互影响致使生成的晶体尺寸较小; 当有机物含量低时,晶体生长互不影响,可生成形貌规整、尺寸较大的晶体。此外,蛋白质可作为晶体的成核位点,蛋白质含量或纯度高常导致成核点过多,限制了大尺寸晶体的生长。自然界中土的粒径和成分千差万别,胶结加固所需的碳酸钙也不尽相同,统一的培养基配方是否合理值得商榷。本试验得到的关于蛋白胨配方和纯度的结论适用于巴氏芽孢杆菌的培养及粉土加固。关于如何进一步提升产脲酶菌的培养效率以及降低成本等还需开展更深入的研究。

赵志峰,韩劭恒.蛋白胨对微生物诱导碳酸钙沉积的影响[J].林业工程学报,2025,10(6):127-133.

ZHAO Z F,HAN S H.Effect of peptone on urease producing bacteria induced calcium carbonate precipitation[J].Journal of Forestry Engineering,2025,10(6):127-133.

把时间交给阅读