东北农业大学陈庆山教授/齐照明研究员团队利用单细胞转录组揭示FA9–VAP模块调控大豆种子脂肪酸积累新机制
近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由东北农业大学陈庆山教授、齐照明研究员团队撰写的“Single-cell transcriptomics reveals the FA9–VAP module regulating fatty acid accumulation in soybean seeds”论文。该研究综合利用单细胞转录组测序（scRNA-seq）、空间转录组测序（stRNA-seq）、蛋白质免疫共沉淀-质谱（IP–MS）、蛋白互作分析、基因编辑以及透射电子显微镜观察等技术，深入解析了大豆品质基因FA9调控种子脂肪酸积累的分子机制，鉴定出其关键互作蛋白VAP，并提出了FA9–VAP模块参与内质网—脂滴（ER–LD）界面调控脂滴形成和种子脂肪酸积累的模型。陈庆山教授/齐照明研究员团队长期致力于大豆品质生物学研究，重点关注大豆种子油脂和蛋白质等重要品质性状形成的遗传与分子基础。团队前期鉴定了调控大豆种子脂肪酸含量的重要位点Fatty Acid 9（FA9），发现其编码一个SEIPIN同源蛋白，并证明FA9能够显著影响大豆种子脂肪酸和蛋白质含量及种子大小等性状（Qi et al., 2023. doi: 10.1111/pbi.14222）。然而，FA9作为一个SEIPIN家族蛋白，究竟在哪些种子细胞中发挥作用，又通过哪些互作蛋白调控脂滴形成和脂肪酸积累，仍缺乏直接证据。围绕这一问题，本研究从单细胞水平解析FA9的细胞类型特异性，并进一步结合蛋白质组学和遗传学实验追踪其作用机制。研究人员选取大豆品种东农50及其 fa9-KOB 突变体晚熟期种子，分别设置3个独立生物学重复进行scRNA-seq分析。研究共获得697.84 Gb原始数据，初始捕获72,088个细胞；经过质量控制后，最终获得 60,489个高质量细胞，检测到44,856个表达基因。进一步通过UMAP降维和聚类，将这些细胞划分为 26个转录特征不同的细胞群。结合已报道的大豆或拟南芥种子细胞marker、数据库信息以及cluster特异表达基因，研究对主要细胞群进行了功能注释，识别出子叶、胚轴/分生组织相关细胞、胚根和种皮等主要种子细胞类型。其中24个cluster获得了较明确的细胞类型注释，为后续研究FA9在不同细胞中的作用奠定了基础。图1. 大豆晚熟期种子单细胞转录组图谱及主要细胞类型注释。2. 单细胞与空间转录组联合分析解析FA9的细胞类型特异性单细胞转录组分析显示，FA9主要富集于cluster 14、22和24，其中在cluster 14中的表达水平最高。FA9敲除后，这些FA9高表达细胞群在转录层面发生了明显的变化。cluster 14、22和24中分别鉴定到4,418、896和92个差异表达基因，涉及脂肪酸代谢、内质网蛋白加工、过氧化物酶体、α-亚麻酸代谢、脂滴组织及胁迫响应等多个生物学过程。为进一步确定这些细胞群在种子中的空间位置，研究利用10× Visium开展空间转录组分析，共获得6,818个有效空间spots。空间转录组marker在相应单细胞cluster中的表达总体一致；反过来，将scRNA-seq鉴定的marker映射回空间组织，也获得了与细胞类型注释相吻合的空间表达模式。研究还利用拟时序分析考察了FA9缺失后不同细胞转录状态的变化。结果显示，FA9敲除与子叶细胞中储藏物质积累相关转录状态的改变密切相关。图2. FA9高表达细胞群、拟时序变化及FA9相关候选调控网络。3. 多组学联合筛选并验证FA9关键互作蛋白VAP在明确FA9的细胞类型特异性后，研究进一步寻找可能与FA9共同调控油脂积累的蛋白。研究首先针对FA9高表达细胞群开展共表达网络分析，同时利用FA9过表达大豆材料进行IP–MS分析，共鉴定到903个蛋白，其中726个蛋白得到定量。将FA9高表达细胞群中的差异表达基因与IP–MS结果进行联合分析后，共获得148个重叠候选基因/蛋白，并进一步筛选出15个候选蛋白进行验证。其中，定位于内质网的vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated protein（VAP）首先得到了关注。随后通过双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）和酵母双杂交（Y2H）等实验，均验证了FA9与VAP之间的互作关系。亚细胞定位结果显示，FA9和VAP主要分布于内质网等细胞器中。FA9拓扑结构预测显示，其N端位于细胞质侧，并含有一个FFAT motif。进一步的Y2H截短分析表明，FA9的N端对于FA9–VAP互作十分重要。RNA原位杂交还显示，FA9和VAP在种子中的表达区域具有较强一致性，二者在胚根和子叶中的信号尤其明显。4. FA9与VAP共同影响脂滴形成和大豆种子品质为了进一步验证VAP在FA9调控途径中的功能，研究利用CRISPR–Cas9基因编辑技术获得了两个独立的vap敲除株系（vap-KO1和vap-KO2），以及fa9-vap双突变体。与野生型相比，vap单敲除和fa9-vap双突变材料的种子蛋白质含量升高、总脂肪酸含量下降，脂肪酸组成也发生明显变化。双突变体在部分品质性状上的变化更加明显，表明FA9和VAP在大豆种子储藏物积累过程中具有紧密的功能联系。透射电子显微镜进一步发现，不同突变材料在早熟期尚未表现出明显的脂滴差异，但随着种子成熟，突变体中的脂滴数量明显下降，并出现异常增大的畸形脂滴，同时蛋白体数量逐渐增加。CLO、PDAT、DGAT1A、DGAT1B、PDCT1、PDCT2、OLE和FATB等多种与脂质合成和脂滴形成相关的基因在突变体中也表现出不同程度的下调。除品质性状外，FA9和VAP突变还影响种子大小和部分产量相关性状。vap和双突变材料的百粒重、种子长度和宽度都有所增加，但单株种子数和单株种子重量则下降，说明FA9–VAP模块还可能参与种子大小、品质和产量之间的相互协调。图4. FA9和VAP功能缺失对大豆种子油脂、蛋白质、脂滴形态及农艺性状的影响。5. 构建FA9–VAP调控脂滴形成和油脂积累的模型综合单细胞转录组、空间转录组、蛋白互作、遗传学和超微结构分析等结果，作者提出了FA9–VAP调控大豆种子油脂积累的工作模型。在正常情况下，作为SEIPIN同源蛋白的FA9定位于内质网并参与脂滴形成。随着TAG在内质网膜中积累和新生脂滴逐步增大，FA9与内质网定位的VAP发生互作，共同参与维持正常的脂滴形成与生长。当FA9或VAP功能受到破坏时，脂滴数量减少并出现异常增大，同时多个脂质合成相关基因表达量下降，最终导致种子油脂积累减少，并伴随蛋白质含量的改变。图5. FA9–VAP模块调控大豆种子脂滴形成与油脂积累的工作模型。本研究将单细胞与空间转录组应用于大豆晚熟期种子品质调控研究，从细胞类型层面揭示了FA9功能的空间和转录异质性，并进一步将多组学数据与IP–MS结合，鉴定并验证了关键互作蛋白VAP。如果说团队前期研究主要解决了“FA9是什么、FA9自然变异如何影响大豆种子品质”的问题，本研究则进一步回答了“FA9在哪些细胞中发挥作用、与谁互作，以及如何影响脂滴形成和油脂积累”。由此，FA9的研究从自然变异和基因功能初探进一步延伸至单细胞调控、蛋白互作和细胞器发生机制。研究揭示的FA9–VAP模块不仅丰富了对植物SEIPIN调控脂滴形成机制的认识，也为进一步协调大豆种子油脂、蛋白质及产量相关性状提供了新的候选基因和理论基础。东北农业大学已毕业博士生李慧（现工作于黑龙江省农业科学院），在读博士生李天书为论文共同第一作者，王遂博士、陈庆山教授和齐照明研究员为共同通讯作者。研究得到了国家自然科学基金、黑龙江省重点研发计划、黑龙江省自然科学基金、海南种业实验室及国家现代农业产业技术体系等项目的支持。论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70750
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