FSAP | 内蒙古农业大学王俊国教授等:为痛风防治提供新思路:乳酸菌的体外降尿酸机制与活性获验证

内蒙古农业大学食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室、农业农村部奶制品加工重点实验室王培西、鄂晶晶、李婧（共同一作）等筛选多株乳酸菌，并进一步从活菌与死菌、胞内提取物（cell-free intracellular extracts，CFE）与胞外分泌物（cell-free excretory supernatants，CFS）等多个维度比较其抑制效果，阐明不同菌株的作用成分差异。同时，研究结合抗氧化活性评价，探讨其与黄嘌呤氧化酶抑制功能之间的相关性，以揭示乳酸菌降尿酸（uric acid，UA）作用的潜在机制。

Introduction

UA是嘌呤氧化的终产物，由核苷酸和三磷酸腺苷代谢产生。人体内产生过多的UA，或者排泄不良，会形成晶体并沉积在体内，而由于缺乏将尿酸盐转换为水溶性尿囊素的酶，最终导致高尿酸血症的发生。多项研究表明，乳酸菌作为一种食品级微生物，对宿主的健康具有积极作用。乳酸菌在降低UA含量方面的文献报道较少，但在预防和辅助治疗高尿酸血症方面表现了出较好的潜力。

乳酸菌的嘌呤代谢通路中，单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）通过2 种不同的机制转化为肌苷；首先通过脱氨酶去除氨基以形成肌苷单磷酸（inosine monophosphate，IMP），然后用核苷酸酶去磷酸化以形成肌苷。第二种方式是通过核苷酸酶去除磷酸基团以形成腺苷，然后脱氨以形成肌苷。鸟嘌呤单磷酸（guanosine monophosphate，GMP）通过核苷酸酶转化为鸟苷。肌苷和鸟苷分别通过嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）进一步转化为次黄嘌呤和鸟嘌呤。次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶氧化形成黄嘌呤，鸟嘌呤被鸟嘌呤脱氨酶脱氨形成黄嘌呤。形成的黄嘌呤再次被黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）氧化形成最终产物UA。因此乳酸菌有两种途径降解UA，其一是乳酸菌可能会利用嘌呤、核苷等中间产物，降低其在肠道内的吸收，或者抑制其生成，从而来抑制UA的生成，或者可作为黄嘌呤氧化酶抑制剂抑制UA的生成。

Results

1 降嘌呤乳酸菌的筛选

1.1 标准曲线制作

具体标准曲线结果如图1所示。

图1嘌呤的标准曲线

1.2 乳酸菌降嘌呤能力

结果表明，16 株乳酸菌对黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤具有一定的降解作用，但是降解率均未超过20%，说明本研究中选择的乳酸菌嘌呤降解能力较弱，因此接下来本研究对上述16 株乳酸菌的黄嘌呤氧化酶抑制作用进行了测试。

图2乳酸菌降嘌呤能力

2 具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的乳酸菌

2.1 不同浓度菌悬液的黄嘌呤氧化酶抑制能力

结果表明，16 株菌的菌悬液黄嘌呤氧化酶抑制率均随着浓度的增加而增加，但是在菌浓度达到1×10⁸ CFU/mL后，抑制率的增加逐渐开始减缓，部分乳酸菌的抑制率表现出降低的趋势。因此，选取菌浓度为1×10⁸ CFU/mL进行下一步研究。

图3不同浓度的菌悬液对黄嘌呤氧化酶的抑制

2.2 菌悬液的黄嘌呤氧化酶抑制能力

结果表明，16 株乳酸菌中L. helveticus M1-2的活菌悬液对黄嘌呤氧化酶抑制率均最高，在8 min时达到最高抑制率为67.56%（图4）。其次活菌悬液中黄嘌呤氧化酶抑制效果较好的还有L. plantarum HN2-3、L. rhamnosus N1-4、S. thermophilus ST0、L. helveticus M1-1、L. plantarum N2-4，HN2-3和ST0活菌悬液黄嘌呤氧化酶抑制率在10 min时分别为66.26%、64.99%，N1-4、M1-1及N2-4在8 min时达到最高分别为65.84%、62.88%、57.63%，但均低于别嘌呤醇的作用（图4）。

图4活菌悬液不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力

3 乳酸菌对黄嘌呤氧化酶抑制机制的初步研究

3.1 菌株活性对黄嘌呤氧化酶抑制作用的影响

结果表明，乳酸菌在致死后对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用，部分菌株致死后与活菌抑制率无显著性差异（P＞0.05），甚至大部分菌株致死后抑制能力显著高于活菌的作用（P＜0.05），表明测试的乳酸菌活性对于黄嘌呤氧化酶抑制作用影响较小。

图5死菌悬液不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力（a、b）、菌悬液的黄嘌呤氧化酶抑制作用（c）

3.2 不同时间段的胞内物对黄嘌呤氧化酶的抑制能力

活、死菌胞内物均有抑制黄嘌呤氧化酶的作用，且不同乳酸菌的抑制率和达到最高的时间不同。

图6活菌胞内物不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力（a、b）、死菌胞内物不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力（c、d）

3.3 不同时间段的胞外分泌物抑制黄嘌呤氧化酶作用

死、活菌的胞外分泌物及胞内物对黄嘌呤氧化酶均具有一定的抑制作用，但是具体是什么成分起到作用还需要进一步研究，因此综合上述实验结果选择黄嘌呤氧化酶抑制较高的HN2-3、M1-1、M1-2、N1-4、N2-4、ST0进行下一步分析。

图7活菌胞外分泌物不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力（a、b）、死菌胞外分泌物不同时间段对黄嘌呤氧化酶抑制能力（c、d）

3.4 胞内物及胞外分泌物的黄嘌呤氧化酶抑制作用

结果表明，乳酸菌的不同成分对黄嘌呤氧化酶的抑制效果存在差异性。

图8胞外分泌物及胞内物抑制黄嘌呤氧化酶能力

4 具有黄嘌呤氧化酶抑制作用乳酸菌的抗氧化性

4.1 不同浓度死、活菌菌液的抗氧化性

随着菌悬液浓度的增加，6 株乳酸菌的羟自由基、超氧阴离子及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率均增加，呈正相关。结果表明，6 株乳酸菌的抗氧化性也随着菌悬液浓度的升高而升高与菌的死活无关。

图9 不同浓度菌悬液的羟自由基清除率（a）、超氧阴离子清除率（b）、DPPH自由基清除率（c）

4.2 菌株羟自由基、超氧阴离子、DPPH清除率

乳酸菌各组分清除率方面，HN2-3、N1-4、M1-1、ST0、M1-2活菌的胞内物与胞外物无显著性差异（P＞0.05），N2-4的CFE显著高于其CFS的清除效果（P＜0.05）；HN2-3、N1-4及N2-4死菌的CFE显著高于CFS的清除率（P＜0.05），M1-1及ST0二者之间无显著性差异（P＞0.05），而M1-2死菌的CFS则显著高于CFE的清除率（P＜0.05）。乳酸菌灭活前后的清除率方面，HN2-3活菌的CFS显著高于灭活后（P＜0.05），其余菌灭活前后的胞外物无显著性差异（P＞0.05）；N1-4死菌的CFE清除率高于其灭活前，其余乳酸菌活菌的CFE显著高于其死菌的CFE（P＜0.05）；但是整体上各作用成分灭活前后的清除能力区别较小。

图10菌株羟自由基清除能力（a）、菌株超氧阴离子清除率（b）、菌株的DPPH自由基清除活性（c）

4.3 乳酸菌N1-4黄嘌呤氧化酶抑制与抗氧化性相关性分析

如表1所示，乳酸菌活菌悬液的黄嘌呤氧化酶抑制活性与羟自由基、超氧阴离子及DPPH自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05），而死菌悬液中的黄嘌呤氧化酶抑制活性只与羟自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05），与超氧阴离子和DPPH清除率无显著性（P＞0.05），且菌株的抗氧化性与菌的死活无关。

表1乳酸菌N1-4黄嘌呤氧化酶抑制活性与抗氧化活性的关系

Conclusion

无论菌株是否存活，6 株乳酸菌的菌悬液、胞内物及胞外分泌物对于羟自由基、超氧阴离子及DPPH均具有不同程度的清除作用。整体而言，乳酸菌的黄嘌呤氧化酶抑制活性与其抗氧化性呈正相关，支持其在高尿酸血症和痛风治疗中的潜在应用。

作者介绍

王俊国，博士、教授、博士研究生导师。主持科研项目包括：1.国家自然科学基金项目（31660456）；2.内蒙古自治区配套中科院西部之光人才培养项目；3.内蒙古自然科学基金项目（2015MS0306）；4.国家自然科学基金项目（31160315）；5.中科院西部之光人才培养项目；6.内蒙古农业大学博士启动基金项目（BJ08-18）；7.国家自然科学基金项目（30840011）；8.内蒙古自然科学基金项目（200508010406）。共发表学术论文30余篇，其中以第一作者发表论文7 篇，以通信作者发表论文14 篇。申请发明专利2 项。“双歧杆菌V9的创新研究及产业化开发”项目获得内蒙古科学技术进步一等奖。编写教材包括：《乳品加工实验》《农产品贮藏与物流学》《发酵食品工艺学》《功能性食品学》。