ICP | 安徽农业大学:内生菌CsE7通过固氮与促生提升夏秋茶品质的机制与应用潜力
作为中国重要的经济作物，茶叶的风味品质对其经济价值具有决定性作用，也是茶产业高质量发展竞争优势的关键因素。接种内生菌Luteibacter sp. CsE7的茶树能显著提升固氮能力并改善茶产品风味品质，从而提高夏秋茶的资源利用效率与经济价值。本研究系统考察了内生菌CsE7对茶树全氮含量、生长状态及品质相关化合物的影响，通过评估其固氮与植物促生（PGP）活性，验证其作为固氮促生菌的功能有效性。基于CsE7的基因组与转录组分析，鉴定出CsENifB1和CsENifB2两种关键固氮酶蛋白是其固氮能力的主要贡献者；对PGP特性的研究发现，CsE7通过产生植物激素、协助铁载体生物合成及合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶促进植物生长。根据灌溉接种CsE7处理茶梢的评估结果，观察到CsE7能显著增加百芽重、促进腋芽发育并增强茎秆伸长。接种CsE7可提升茶梢游离氨基酸及茶氨酸含量，在维持茶多酚与氨基酸比值的同时丰富滋味特征。综上，Luteibacter sp. CsE7展现出显著的固氮与促生能力，从而有效提升茶梢品质。该发现凸显了其对夏秋茶产业的潜在重要意义，并为改善茶叶风味品质提供了新思路。(1) CsE7通过CsENifB1和CsENifB2的作用增强茶梢固氮能力。(2) CsE7表现出植物促生活性，促进夏秋茶梢生长。(3) CsE7灌溉处理可同时改善夏秋茶风味品质与产量。(4) 内生菌CsE7有效提高了夏秋茶的资源利用效率。篇名: Elevating summer-autumn tea's utilization value: The role of endophyte CsE7 in enhancing growth and quality期刊: Industrial Crops and ProductsDOI: 10.1016/j.indcrop.2026.123240该研究利用GFP标记（CsE7-GFP）结合RT-qPCR示踪菌株在茶苗体内的定殖与迁移；通过基因组与转录组分析鉴定关键氮酶基因CsENifB1/B2，并构建基因敲除突变体验证功能；采用LC-MS/MS检测菌株分泌的植物激素（如IAA）；在温室及自然茶园环境下，通过土壤灌溉接种评估对茶梢生长指标（百芽重、茎长）及品质成分（茶氨酸、多酚、咖啡碱）的实际影响。为评估内生菌CsE7-GFP的氮源趋向性，采用注射接种法进行实验。所有处理组叶片均注射GFP标记的CsE7菌株（CsE7-GFP），其中一组使用双蒸水（ddH₂O）培养，另一组使用10 mM (NH₄)₂SO₄培养，随后测定茶树地上部与地下部GFP相对表达量以明确(NH₄)₂SO₄处理下CsE7-GFP的迁移趋势。ddH₂O处理8小时后，CsE7-GFP主要富集于地上部，其GFP相对表达量占植株总表达量的80%以上；而(NH₄)₂SO₄处理下，1、4、8小时时CsE7-GFP在植株地下部与地上部的分布均较均衡，地下部GFP相对表达量约占全株总表达量的50%。与ddH₂O处理相比，(NH₄)₂SO₄作用于茶树根系时，叶片中CsE7-GFP内生菌积累减少而根部增多，表明CsE7-GFP倾向于向10 mM (NH₄)₂SO₄定向迁移，并在短期处理中从茶梢向根系转移（图1B）。为探究内生菌CsE7对根际土壤及茶树全氮水平的影响，通过土壤灌溉对两年生茶苗进行CsE7处理。结果显示，相较于灭活菌（DE7，100℃处理20分钟）与双蒸水（ddH₂O）处理，CsE7处理下茶梢全氮含量提升约24%，而土壤全氮含量未受影响（图1C-E）。通过平板实验评估CsE7菌株的固氮能力。如图2A-B所示，CsE7在无结合态无机/有机氮源的选择性培养基（Ashby甘露醇培养基）中正常生长，而阴性对照菌株大肠杆菌JM109未生长，表明CsE7具有显著的固氮与植物促生潜力。为分析CsE7对体外不同氮源的偏好性，将其接种于含10 mM单一氮源的培养基中培养7天并观察菌落生长状态。CsE7在所有含氮培养基中均可生长，但菌落大小存在差异：在铵态氮（(NH₄)₂SO₄）、铵硝混合氮（NH₄NO₃）和硝态氮（KNO₃）作为唯一氮源的条件下，(NH₄)₂SO₄培养基中CsE7生长最快且菌落最大（图2C），NH₄NO₃培养基次之（图2D），KNO₃培养基中生长最缓且菌落最小（图2E）。在谷氨酰胺（Gln）、茶氨酸（Thea）和乙胺盐酸盐（EA）的氮源偏好性测试中，CsE7在Gln上的生长状态最佳，与(NH₄)₂SO₄培养基相当（图2F）；而在Thea与EA培养基中生长较差，表现为菌落微小且形成白色斑块（图2G-H）。这些结果说明NH₄⁺更有利于CsE7的体外生长，与茶树对NH₄⁺的偏好特性一致。图2. CsE7的体外固氮能力及氮源形式偏好性。（A）在无结合态无机/有机氮源的Ashby甘露醇培养基上评估CsE7生长情况，大肠杆菌JM109作为阴性对照；（B）CsE7与JM109在液体Ashby甘露醇培养基中培养的OD600值动态监测；（C-H）CsE7在含10 mM不同氮源（(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、KNO₃、Gln、Thea和EA）的Ashby甘露醇固体培养基中培养7天的生长状态。数据以均值±标准差表示（B组n=3，C-H组n=5），C-H图中不同小写字母标注组间显著性差异（p<0.05，双因素方差分析）。实验重复三次，结果一致。内生菌CsE7具有一条环状染色体，全长4,699,953碱基对，鸟嘌呤-胞嘧啶（G+C）平均含量为65.97%（图3A）。该染色体包含3974个潜在蛋白质编码基因、6个核糖体RNA（rRNA）、52个转移RNA（tRNA）及3个基因组岛。在预测的3974个基因中，3857个基因（97.06%）已获得功能注释，117个基因编码未知功能蛋白（表S2）。KEGG富集分析揭示了11条与氨基酸代谢、碳水化合物代谢及能量代谢等相关通路（图3B）。前期研究表明，CsE7可能通过增强氮同化作用（如Gln-Thea-Glu循环）激活氮响应转录因子，这些因子已被报道与次生代谢基因网络存在交叉调控（Chang等，2023）。转录组测序分析显示，在LB-2h vs. TH-2h、LB-12h vs. TH-12h和LB-24h vs. TH-24h三组比较中，分别检测到240、289和369个差异表达基因（DEGs）。通过三组DEGs交叉比对，鉴定出37个共表达基因（图3C及表S4），其中NPGAP_15010与NPGAP_12385两个基因与固氮功能相关。为探究CsE7固氮功能的进化路径，我们基于其基因组中31个固氮相关基因的推导氨基酸序列，以及大豆根瘤菌的两个固氮基因（WP_015921041和WP_014333904）构建系统发育树。值得注意的是，NPGAP_15010和NPGAP_12385蛋白与大豆根瘤菌NifB家族固氮蛋白具有同源性，提示其潜在固氮功能（图3D）。NPGAP_15010和NPGAP_12385的DNA序列详见补充数据。图3. 内生菌CsE7基因组特征概览及固氮酶基因鉴定。（A）染色体图谱显示CsENifB基因在CsE7基因组中的分布，箭头标注其基因组位置；（B）KEGG功能注释结果，横轴为基因数量，纵轴为代谢通路；（C）维恩图展示不同处理下的差异表达基因（DEGs）；（D）内生菌CsE7中CsENifB蛋白的系统发育分析，红色星号标记本研究的目标蛋白，以大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）USDA 110菌株的Nif蛋白作为参考。(4)CsENifB1与CsENifB2对CsE7固氮能力的贡献如图4A-B所示，编码CsENifB1（1350 bp）和CsENifB2（1317 bp）的基因成功从CsE7基因组中敲除，分别获得突变株CsE7nifb1和CsE7nifb2。通过引物对US-F和DS-R对DNA片段进行克隆验证：野生型CsE7菌株的PCR扩增产物约为2.2 kb，而突变株CsE7nifb1和CsE7nifb2的产物约为0.8 kb（图4C）。以JM109-EV为阴性对照，互补菌株JM109-NifB1和JM109-NifB2中成功克隆出CsENifB1与CsENifB2的完整编码序列（CDS），证实互补菌株构建成功（图4D）。在无氮选择条件下，突变株CsE7nifb1和CsE7nifb2的生长量显著低于野生型CsE7；而互补菌株JM109-NifB1和JM109-NifB2的生长量较对照菌株JM109-EV明显提升（图4E）。乙炔还原实验（ARA）进一步表明，敲除CsENifB1（16.90 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）和CsENifB2（24.47 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）基因导致CsE7的乙炔还原活性（51.03 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）显著降低；而互补菌株JM109-ENifB1（35.74 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）和JM109-CsENifB2（48.83 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）的乙炔还原活性较JM109-EV（1.31 nmol C₂H₂ mg⁻¹蛋白 h⁻¹）大幅提升（图4F）。本研究中，内生菌CsE7的乙炔还原活性显著高于已报道的其他内生菌，但固氮基因重组菌株JM109-ENifB1和JM109-ENifB2的活性并非最优（表1）。
图4. 突变株与互补菌株固氮能力分析。（A-B）相较于野生型CsE7，突变株CsE7nifb1和CsE7nifb2中CsENifB1或CsENifB2编码基因被完全删除。菌株CsE7基因组中橙色框表示上游（US）区域，蓝色框表示下游（DS）区域，绿色与粉色框分别代表CsENifB1和CsENifB2编码基因；（C）野生型CsE7基因组PCR产物约2.2 Kb（泳道1和3），突变株CsE7nifb1和CsE7nifb2基因组产物约0.8 Kb（泳道2和4）；（D）JM109-CsENifB1和JM109-CsENifB2菌株基因组PCR产物约1.3 Kb（泳道1和2），JM109-EV无产物（泳道3），泳道M为DNA标记，箭头标注不同片段大小；（E）突变株CsE7nifb1、CsE7nifb2及互补菌株JM109-CsENifB1、JM109-CsENifB2的OD600动态变化，以内生菌CsE7和JM109为对照；（F）突变株（CsE7nifb1和CsE7nifb2）与互补菌株（JM109-CsENifB1和JM109-CsENifB2）的乙炔还原活性（ARA）分析，以CsE7和JM109为对照。数据为均值±标准差（n=5），统计学显著性采用Student’s t检验（***p<0.001，****p<0.0001）。通过分析吲哚乙酸（IAA）合成能力与1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶活性，本研究评估了内生菌CsE7的植物促生潜力。LC-MS/MS分析表明，CsE7可独立合成IAA（图5A）。进一步检测其植物促生（PGP）特性发现，该菌株在体外具有ACC脱氨酶活性，并能分泌铁载体（图5B）。这些结果证实CsE7兼具IAA合成、ACC脱氨酶活性和铁载体产生能力，表明其作为植物促生菌（PGPB）的潜力。植物激素的全面定量分析显示，除IAA外，CsE7还能独立合成赤霉素、细胞分裂素和水杨酸（图5C）。本研究所检测的激素类化合物详细信息见表S3。代谢物通过KEGG化合物数据库注释并与KEGG通路数据库关联。如图5D所示，六条代谢通路显著富集：次生代谢、二萜生物合成、玉米素生物合成、色氨酸代谢及植物激素信号转导通路。研究结果表明，CsE7通过调控植物激素水平（如生长素和茉莉酸）可能作为信号分子影响次生代谢相关基因的表达，该发现与我们前期研究（Sun等，2019）及当前研究结论（Chang等，2023）一致。图5. 内生菌CsE7的植物促生特性。（A）HPLC色谱图与MS/MS分析对比IAA标准品（黑色峰）与CsE7培养基（红色峰），显示IAA标准品的色谱峰与质谱图；（B）CsE7在28℃液体LB培养基中培养7-10天后，离心收集菌体，用无菌水洗涤重悬并涂布于含Dworkin-Foster（DF）盐基础培养基和3 mM ACC的琼脂平板。铁载体产生通过铬天青S（CAS）平板检测，菌落周围橙色晕圈为阳性特征。实验重复三次结果一致；（C）植物激素的定量分析热图，数据为均值±标准差（n=3）；（D）内生菌CsE7的KEGG功能注释。作为一种可定殖多种环境或植物的细菌，CsE7具有替代传统施肥的应用潜力。为评估CsE7对茶树的促生效应，我们开展了CsE7田间灌溉试验（图6A-B）。与H₂O处理相比，CsE7处理显著提升了多项生长指标，包括百芽重（图6C、E）、腋芽重（图6C、F）、一芽三叶茎长（图6D、G）及株高增长量（图6A、H）。结果表明，CsE7发酵液能有效促进茶梢生长。图6. CsE7对茶梢生长的促进作用。（A）处理前后茶树生长记录，每行分别代表H₂O、DE7和CsE7处理后的表型变化，各处理茶园面积约300 m²，红色箭头标注处理前后株高；（B）H₂O、DE7和CsE7灌溉处理示意图；（C）不同处理下顶芽与腋芽样本图像；（D）不同处理茶梢状态观察，同步测定百芽重（E）、腋芽重（F）、一芽三叶茎长（G）及灌溉处理后株高增长量（H）。比例尺：D图中2 cm。数据以均值±标准差表示（n=5），统计学显著性采用Student's t检验（*p<0.05，**p<0.01）。如图7所示，与H₂O和DE7处理相比，CsE7处理组游离氨基酸含量提升约18%（图7A）。CsE7与DE7处理下，茶多酚总量和儿茶素总量较H₂O处理分别增加约22%与16%（图7B-C）。儿茶素以非酯型与酯型异构体形式存在，其中EGCG含量增加约20%（图7E），而GC、EC和ECG在CsE7与H₂O处理间分别提升44%、33%和50%（图S1）。此外，相较于灭活菌（DE7）与无菌水（H₂O）处理，CsE7处理使土壤和茶梢全氮含量提高约26%（图7G-H）。三种处理对水浸出物含量无显著影响（图7I），但茶氨酸含量在CsE7（28%）和DE7（16%）处理下显著增加（图7D）。值得注意的是，DE7处理导致茶多酚与氨基酸比值上升约15%，而CsE7处理未引起该比值变化（图7F）。图7. CsE7对茶梢次生代谢物积累的促进作用。不同灌溉处理后茶梢中游离氨基酸（A）、茶多酚总量（B）、儿茶素总量（C）、茶氨酸（D）、EGCG（E）、茶多酚/氨基酸比值（F）、全氮（H）及水浸出物（I）含量变化；（G）不同处理下土壤全氮含量。数据以均值±标准差表示（n=5），统计学显著性采用Student's t检验（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。综上所述，内生菌CsE7对夏秋茶的生物强化处理在固氮作用、生长状态及品质相关成分方面产生多重效应：（1）内生菌Luteibacter sp. CsE7通过固氮酶CsENifB1与CsENifB2的活性发挥固氮功能，从而提升茶树氮素利用效率；（2）CsE7作为植物促生菌，可增加茶梢百芽重、腋芽重及茎秆长度，有助于提高夏秋茶产量；（3）CsE7显著增强滋味丰富度并提升夏秋茶梢经济价值。总体而言，Luteibacter sp. CsE7展现出固氮与促生双重功能，有效改善夏秋茶梢品质。这表明内生菌CsE7的科学适度应用对提升夏秋茶资源利用效率具有积极意义。
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