PCE | 南京农业大学:基因型依赖的根际微生物组装配提高低钾胁迫下梨砧木的钾利用效率
钾（K）是影响梨（Pyrus spp.）果实品质的重要营养元素，而根际微生物在增强植物对钾的吸收与利用方面发挥着关键作用。为探究根际微生物组对梨钾利用效率（KUE）的基因型依赖性影响，本研究以两种钾利用效率存在差异的砧木（Pyrus betulaefolia 与Pyrus ussuriensis）为对象，结合盆栽与长期田间试验、16S rRNA扩增子测序及宏基因组分析进行了比较研究。通过合成菌群（SynCom）接种和转录组分析，揭示了增强钾获取的潜在机制。在低钾条件下，P. betulaefolia 招募了独特的微生物群落，通过上调与钾转运及稳态相关的基因（如 ATP1A、kdPB 和COG3158），显著提高了钾的积累量。田间试验进一步证实，在缺钾条件下，与 P. ussuriensis 嫁接的植株相比，P. betulaefolia 嫁接的树体保持了更高的芽孢杆菌科（Bacillaceae）丰度、更优的果实品质以及更高的钾含量。由五种芽孢杆菌科菌株构建的合成菌群，通过促进根系代谢活性、刺激根毛发育、调节钾离子转运蛋白（如 NRT2.4）表达以及激活钙依赖性信号通路，增强了植株对低钾胁迫的耐受性。接种合成菌群后，在钾限制条件下植株各项指标均有显著提升：生物量增加 105.86%，钾积累量提高 164.99%，地上部钾利用指数增强 125.91%。这些研究结果表明，基因型驱动的以芽孢杆菌科为主导的微生物组富集作用显著增强了梨的钾利用效率，为在钾限制条件下开发基于微生物组的生物菌肥以及选育“微生物响应型”砧木以实现可持续果树生产提供了机制性见解。篇名: Genotype-Dependent Rhizosphere Microbiome Assembly Improves Potassium Use Efficiency in Pear Rootstocks Under Low Potassium Stress期刊: Plant, Cell & Environment本研究以钾利用效率不同的两种梨砧木杜梨（P. betulifolia）与秋子梨（P. ussuriensis）为对象，通过灭菌与自然土壤对比试验、长期田间试验及回接试验，结合16S rRNA扩增子测序、宏基因组分析及转录组测序等技术，系统评估了根际微生物对钾吸收的影响。进一步通过分离核心菌株构建合成菌群（SynComs），解析了其促进钾吸收的潜在机制。(1)微生物对 P. betulifolia 与 P. ussuriensis 生长、钾吸收及利用的影响（实验一）在灭菌土壤与自然土壤的对比试验中，微生物的存在显著促进了 P. betulifolia的生长表现。具体而言，P. betulifolia 的株高、茎粗和叶片数均显著增加，最终总生物量提高了63%（图2和图S1）。相比之下，这些微生物对地上部生长的影响在 P. ussuriensis 中并不显著（图2A、B，图S1A–C）。然而，两个基因型在接触微生物后，其根系形态参数均有显著改善，表明微生物对根系发育具有广泛的积极影响（图S1D–F）。在钾吸收方面，微生物显著提高了两个基因型各器官中的钾浓度（图2C）。在 P. betulifolia 中，根、茎和叶的钾含量分别增加了55.95%、10.66%和15.27%。在 P. ussuriensis 中，根、茎和叶的增幅分别为41.88%、52.05%和21.95%。
图2 P. betulifolia 与P. ussuriensis 在灭菌土壤和自然土壤中的生长状况及根际微生物功能差异。 (A) P. betulifolia 和 P. ussuriensis 幼苗在灭菌土壤和自然土壤上生长的照片。(B, C) P. betulifolia 和 P. ussuriensis 幼苗在灭菌土壤和自然土壤上生物量和钾含量的差异。数据以平均值±标准差表示（n=4）。不同字母表示处理间存在显著差异（Tukey's HSD检验，p < 0.05）。(D) 自然土壤中生长的 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 幼苗根际富集微生物在属水平上的α多样性。“*”表示在 p < 0.05 水平存在显著差异，p值使用Welch's t检验确定。(E)基于Bray-Curtis相异度的自然土壤中 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 幼苗根际富集微生物的β多样性。(F, G) 火山图显示在 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 中显著富集或缺失的KO通路和KO功能类别。灰点表示ASV无显著差异，绿点和红点分别表示ASV在 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 中显著富集。(H) P. betulifolia 与 P. ussuriensis 之间钾吸收和转运相关功能基因与蛋白质相对丰度的差异。SB表示生长于灭菌土壤的 P. betulifolia，B表示生长于自然土壤的 P. betulifolia；SU表示生长于灭菌土壤的 P. ussuriensis，U表示生长于自然土壤的 P. ussuriensis。“*”表示在 p < 0.05 水平存在显著差异，p值使用Welch's t检验确定。根际富集微生物对植株总钾积累的贡献率在 P. betulifolia 中（42.60%）也高于 P. ussuriensis（32.17%）（图S1G）。值得注意的是，尽管根际微生物的存在对 P. ussuriensis 的钾吸收效率或钾利用指数没有显著影响，但 P. betulifolia 经历了实质性改善：钾吸收效率提高了74.45%，钾利用指数提高了41.01%（图S1H，I）。这些研究结果表明，微生物能促进梨砧木的生长和钾利用，其中 P. betulifolia 根际富集的微生物可能在增强植株钾吸收与利用方面发挥着重要作用。(2)P. betulifolia 与 P. ussuriensis 根际微生物群落的功能差异（实验一）通过对灭菌与自然土壤对比试验中的细菌和真菌群落进行分析，发现 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 的根际微生物群落在组成和功能上均存在显著差异（图2F、G；图S2、S3）。这表明每个砧木基因型都支持着具有独特功能能力的特定微生物群落。KEGG通路富集分析进一步凸显了这些差异（图S4）：在 P. ussuriensis 中，其微生物群落在与氨基酸代谢和翻译相关的通路中表现出显著富集，特别是氨基糖和核苷酸糖代谢通路（ko00520）（图S4）。相比之下，P. betulifolia 的根际微生物群落在与碳水化合物和能量代谢、辅因子和维生素代谢、萜类和多酮类代谢、脂质代谢、外源生物降解以及多种其他转运过程相关的通路上显著富集。值得注意的是，P. betulifolia 中氮代谢（ko00910）、芳香化合物降解（ko01220）、脂肪酸降解（ko00071）以及几种氨基酸和苯甲酸酯的降解等通路尤为突出。此外，与钾转运相关的基因和蛋白质在两个基因型之间表现出不同的模式。P. betulifolia 根际中 ATP1A（钠/钾转运ATP酶亚基 alpha）、kdPB（钾吸收与转运调节因子）和 COG3158（钾转运蛋白）的表达水平显著高于 P. ussuriensis（图2H）。综上所述，这些研究结果表明，与 P. betulifolia 相关的根际微生物群落在代谢上更为活跃，并且特别在低钾条件下，通过激活功能性反馈通路，能更好地支持钾的吸收与稳态维持。(3)P. betulifolia 根际微生物在增强钾吸收方面的正向功能（实验二）为验证在根际微生物群中观察到的功能差异，研究使用从两种砧木分离的微生物群落进行了微生物再接种试验（图3；图S6、S7；表S1）。在 P. betulifolia 幼苗中，与接种 P. ussuriensis 微生物群（U处理）的幼苗相比，接种其自身根际微生物群（B处理）的幼苗表现出显著更好的地上部和根系生长，包括根长、表面积、体积和根尖数的增加（图3A–C）。类似地，对于 P. ussuriensis 幼苗，接受B处理的幼苗比接种U微生物群的幼苗具有更高的生物量、钾积累量和根系钾含量（图3D–F）。图3 接种实验一中各处理根际土壤悬液后，P. betulifolia（A–C）和 P. ussuriensis（D–F）幼苗的生物量、钾积累量、微生物介导的钾吸收效率（G）、地上部钾利用指数（H）及主成分得分（I）。 数据以平均值±标准差表示（n=3）。不同字母表示处理间存在显著差异（Tukey's HSD检验，p < 0.05）。“*”表示 p < 0.05，“**”表示 p < 0.01，“***”表示p < 0.001。p值使用Welch's t检验确定。SB表示实验一中生长于灭菌土壤的 P. betulifolia 根际微生物悬液，B表示实验一中生长于自然土壤的 P. betulifolia 根际微生物悬液；SU表示实验一中生长于灭菌土壤的 P. ussuriensis 根际微生物悬液，U表示实验一中生长于自然土壤的 P. ussuriensis 根际微生物悬液。对钾吸收速率和地上部钾利用指数的进一步分析表明，在两种砧木基因型中，B处理的表现均一致优于U处理。对这些生理和营养指标的主成分分析证实，P. betulifolia 根际微生物的影响大于 P. ussuriensis（图3I）。此外，接种 P. betulifolia 微生物群的植株表现出更高的微生物介导的钾吸收效率和利用指数（图3G、H），凸显了这些微生物对植株钾营养的有益影响。这些结果强调了根际微生物在增强植株钾效率方面的重要作用，特别是对于 P. betulifolia 的钾营养状况而言。综合来看，实验一和实验二证明，高钾利用效率砧木P. betulifolia所招募的根际微生物群，在受控条件下对植株的钾吸收和利用发挥着可转移的、因果性的有益作用。我们接着探究这种基因型依赖的微生物组功能是否能在嫁接系统中长期低钾胁迫下得以维持，以及是否能转化为根际钾有效性和果实品质方面的差异——这些条件更接近于果园生产实际（实验三）。(4)不同钾处理下 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 砧木嫁接苗的土壤性质、钾含量及果实品质（实验三）为将幼苗试验（实验一和二）中获得的因果性认识拓展到与生产相关的场景，我们在不同钾处理条件下进行了长期的嫁接盆栽试验。在为期四年的低钾盆栽试验中，与中等钾处理对照相比，低钾处理下嫁接苗根际土壤的有效钾含量大幅下降。具体而言，P. betulifolia 嫁接苗根际有效钾下降了64.92%，P. ussuriensis 嫁接苗下降了49.72%，最终值分别降至99.95 mg/kg 和 116.10 mg/kg（表S2），两者均低于果树的标准钾需求量。相应地，在低钾条件下，根、叶和果实中的植株钾浓度显著降低，且 P. ussuriensis 的降幅比 P. betulifolia 更为明显（图4B）。叶片生物量分析显示，在中等钾处理下两种砧木的叶片干重无显著差异；然而，低钾条件导致两种砧木的干重均显著减少，其中 P. ussuriensis 的降幅更大（表S3）。图4 不同钾处理下以 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 为砧木的梨树的钾含量、果实品质及根际细菌群落结构。 (A) 地上部叶片和果实图像。(B) 果实、叶片和根系中的钾含量。(C–E) 果实中可溶性固形物、总可溶性糖和可滴定酸的含量。(F–G) 梨幼苗生理生化指标的主坐标分析（PCA）和主成分得分。(H) 细菌香农指数。字母差异表示显著差异（P < 0.05, n=6）。(I) 基于ASV水平Bray-Curtis距离的细菌群落主坐标分析（PCoA）。(J) 优势细菌属的相对丰度。BF表示低钾处理下以 P. betulifolia 为砧木的嫁接苗，BT表示中等钾处理下以 P. betulifolia 为砧木的嫁接苗；UF表示低钾处理下以 P. ussuriensis 为砧木的嫁接苗，UT表示中等钾处理下以 P. ussuriensis 为砧木的嫁接苗。数据以平均值±标准差表示（n=5）。不同字母表示处理间存在显著差异（Tukey's HSD检验，p < 0.05）。果实品质也受到低钾处理的不利影响。可溶性固形物、总可溶性糖、可滴定酸含量以及果实纵径均显著降低，且 P. ussuriensis 的降幅比 P. betulifolia 更为严重（图4C–E；表S3）。对植株营养和果实品质指标的主成分分析（PCA）显示，不同处理之间存在明显的聚类模式。值得注意的是，P. ussuriensis样本沿PC1轴的分离程度大于 P. betulifolia，表明 P. ussuriensis 的果实品质受低钾条件的不利影响更大（图4F、G）。这些研究结果表明，低钾有效性对 P. ussuriensis 嫁接苗的营养状况和果实品质产生的不利影响比 P. betulifolia 嫁接苗更为严重，突显了后者在钾限制条件下具有更高的钾效率和胁迫耐受性。(5)嫁接苗根际微生物多样性与组成的变化（实验三）为探究低钾条件下砧木基因型富集的根际微生物群与果实品质之间的关系，我们分析了与嫁接苗相关的微生物群落。在低钾处理下，P. betulifolia 嫁接苗根际细菌的香农多样性指数显著低于中等钾处理，而 P. ussuriensis 则未观察到显著变化。两种砧木和各处理间的真菌群落多样性均保持不变。然而，β多样性分析显示，P. betulifolia 在低钾与中等钾条件下的细菌群落结构存在明显分离，而 P. ussuriensis 中未观察到这种模式（图4H–J；图S8）。PERMANOVA分析证实，砧木基因型对细菌（R² = 0.099）和真菌（R² = 0.081）群落组成的影响最强（p < 0.005），其次是钾处理（细菌 R² = 0.061，真菌 R² = 0.069；p < 0.05）（表S4）。这些结果表明，P. betulifolia 在响应低钾胁迫时，其根际微生物群落的动态变化比 P. ussuriensis 更为显著。在属水平上，低钾处理显著增加了 P. betulifolia 中 Bacillus 属的丰度，而在P. ussuriensis 中未检测到显著变化（图4J）。扩增子序列变体（ASV）分析显示，有5个细菌属和8个真菌属在两种砧木中均响应低钾处理而普遍富集或缺失，其中 P. betulifolia 展现出更多受低钾条件特异性影响的独特ASV（图S9；表S5）。值得注意的是，P. betulifolia 中来自芽孢杆菌科（Bacillaceae）的ASV在低钾处理下显著增加，丰度达到6.063。综上所述，这些结果表明基因型对群落组成的影响强于钾处理，而低钾条件则加剧了基因型特异性的微生物变化。微生物多样性指数、差异属、环境因子与果实品质指标之间的相关性分析显示，P. ussuriensis 的细菌和真菌的α及β多样性与环境或果实品质参数均无显著相关性（图S10）。相比之下，P. betulifolia 的细菌α和β多样性与果实品质呈正相关，而真菌多样性则呈显著负相关。在属水平上，Sphingomonas、Novosphingobium 和 Rhizobium 的丰度与土壤钾含量和果实品质呈正相关，而Methylophilus、Bacillus 和Neobacillus 则呈负相关。在真菌中，仅有 Albifimbria 属与土壤钾含量和果实品质指标呈显著正相关。(6)P. betulifolia 根际细菌群落，尤其是芽孢杆菌科，对钾有效性表现出增强的响应性（实验三）根际细菌群落的共现网络分析显示，低钾条件显著增加了 P. betulifolia 和 P. ussuriensis 两者细菌网络的复杂性，表现为网络直径、边数、平均度数和模块化程度的显著增加（图5A–D；表S6；表S7）。然而，进一步的相关性分析表明，仅有 P. betulifolia 的细菌群落与根际土壤中的有效钾含量显著相关（图S11），而 P. ussuriensis 未观察到相关性。图5 根际细菌共现网络各模块的组成及其与土壤有效钾含量的相关性。 (A–D) BF、BT、UF和UT处理的根际细菌共现网络。(E) BF处理根际共现网络在科水平的模块化组成。(F) UF处理根际共现网络在科水平的模块化组成。(G) BF处理中具有高特异性（> 0.7）和高占有率（> 0.75）的关键ASV。水平红色虚线表示特异性 > 0.7，垂直红色虚线表示占有率 > 0.75。(H) DF处理中微生物共现网络中心性前20位的拓扑特征值。纵坐标表示核心微生物菌株，按ASV编号。横坐标表示微生物共现网络中心性的拓扑特征值。数值越高，表示该菌株在网络中的核心地位越突出。(I) 特化类群（Specialist）与关键类群（Keystone）之间的共享ASV。交集代表同时具有特化生态位和关键节点作用的微生物。对共生网络模块的详细检查显示，两种砧木均形成八个不同的细菌模块。在 P. betulifolia 中，芽孢杆菌科主导了模块3，约占其组成的25%，并与土壤有效钾含量呈显著负相关（图5E、F；图S12）。相比之下，尽管芽孢杆菌科在 P. ussuriensis 网络的模块8中也较为丰富，但它们与钾水平没有任何显著相关性。这些研究结果表明，P. betulifolia 的根际细菌群落，尤其是芽孢杆菌科，比 P. ussuriensis 的根际细菌群落受到土壤钾有效性的动态调控更为显著。这种对钾波动的增强可塑性和敏感性可能为 P. betulifolia 提供适应性优势，使其在不同土壤条件下能够更有效地觅取养分并具有更强的恢复力。(7)合成微生物群落（SynComs）显著促进梨的生长与钾吸收（实验四）鉴于在长期低钾条件下，芽孢杆菌科（Bacillaceae）特异性成为 P. betulifolia 根际中响应钾胁迫且处于网络核心的模块（实验三），我们优先选择芽孢杆菌科分离株进行合成菌群（SynCom）重构，以验证其因果作用并识别宿主的调控响应（实验四）。从低钾条件下生长的P. betulifolia 根际共分离获得115株细菌。通过鉴定共现网络中前20个高度连接的节点，并选择特异性和占有率值均大于0.7的分类单元，识别出17个核心ASV（表S8，图5G–I）。与先前表征的ASV序列进行比较后，成功分离出5个序列相似度 > 97% 的核心菌株：Priestia（ASV_46, B346）、Ectobacillus（ASV_914, B267）、Mesobacillus（ASV_852, B7）以及两株 Neobacillus（ASV_1244, B18；ASV_2442, B34），这些菌株均属于芽孢杆菌科。为评估这些核心菌株的功能影响，我们构建了一个合成微生物群落（CORE），并将其接种到低钾条件下生长的 P. betulifolia 幼苗根际。接种合成菌群处理下，植株地上部和根系的干重分别为0.049 g和0.024 g，与未接种对照相比分别增加了113.62%和130.60%。钾浓度分别为15.44 mg·kg⁻¹（地上部）和18.16 mg·kg⁻¹（根系），分别提高了6.92%和44.33%（图6A–E）。图6 合成微生物群落的功能验证及其机制性影响。 (A–E) 接种（CORE）与未接种（CK）合成微生物群落对 P. betulifolia 钾吸收和生长的影响。元素分布图像代表钾丰度的分布，红色表示元素含量较高，黑色表示含量较低。“*”表示 p < 0.05，“**”表示 p < 0.01，“***”表示p < 0.001。p值使用Welch's t检验确定。(F) 基于根系表达量信息的主成分分析（PCA）。(G) 根系差异表达基因（DEGs）的汇总。红色表示显著上调的DEGs，蓝色表示显著下调的DEGs。(H)根系的KEGG富集分析。(I) P. betulifolia 根系响应微生物接种的代谢通路示意图。图中方框分别代表对照处理（左）和接种处理（右）中相应基因的相对丰度。根系的转录组学分析显示，在主成分分析（PCA）中，接种合成菌群与对照植株之间存在明显区分，PC1和PC2分别解释了41.30%和28.80%的方差（图6F）。接种合成菌群后，共鉴定出2,048个差异表达基因（DEGs），其中745个上调，1,303个下调（图6G）。DEGs的KEGG通路富集分析表明，它们显著参与了糖酵解/糖异生、甘油磷脂代谢、氮代谢以及植物-病原体互作通路（图6H–I）。关键基因的qPCR验证证实与RNA-Seq结果高度一致（R² = 0.854；表S9；图S14）。在图6I中，左侧和右侧方框分别代表对照处理和接种处理中相应基因的相对丰度。从蓝色到红色的颜色梯度反映了这些基因的相对表达水平，蓝色表示表达量较低，红色表示表达量较高。值得注意的是，与Ca²⁺和NO₃⁻转运相关的基因，以及参与乙酰辅酶A、L-谷氨酸和茉莉酸合成的基因，在响应合成菌群接种时均显著上调。这些研究结果表明，以芽孢杆菌科为主的合成微生物群落可能通过协同调控关键的代谢和转运通路，显著增强梨的生长和钾吸收。本研究系统阐明了根际微生物组影响梨砧木（P. betulifolia 与 P. ussuriensis）钾营养的调控机制及其基因型-微生物组互作模式。结果表明，P. betulifolia 能够招募更为多样且功能特化的微生物群落，特别是富集芽孢杆菌属（Bacillus）物种，这显著增强了钾的溶解释放以及根系的形态适应，如根尖数和侧根密度的增加。相比之下，与 P. ussuriensis 相关的微生物组在低钾胁迫下表现出较低的可塑性，其钾吸收效率也大幅降低。田间试验证实，在长期低钾条件下，与 P. betulifolia 相关的微生物组主要通过持续富集芽孢杆菌属（占核心ASV的60%）来维持更高的果实品质和钾积累量。合成微生物群落的接种进一步验证了芽孢杆菌科能够通过激活三羧酸循环代谢，将根系钾吸收量提高44%。机制研究表明，该微生物组通过茉莉酸信号通路促进根毛发育，并激活了 NRT2.4 钾转运通路。综上所述，这些发现为开发靶向芽孢杆菌的生物菌肥以及选育“微生物响应型”砧木提供了理论依据。同时，这些结果也强调了进一步研究微生物网络动态和根系分泌物反馈机制的重要性，为实现钾资源的高效利用和可持续农业生产开辟了新的途径。
