天然状态的牛乳β-CN以含有5 个磷酸基团的高度磷酸化形式存在，而母乳β-CN是以含0～5 个磷酸基团的低磷酸化形式存在。经酶促脱磷酸处理后，牛乳β-CN可以脱除部分磷酸基团，使其结构更接近母乳。如图3所示，条带1为β-CN，由于其磷酸化程度单一，所以仅有1 个条带；条带2为PDP-BCN，具有数个条带，且都位于天然β-CN条带的上方，分别对应着不同脱磷酸化程度的β-CN，表明在本实验条件下成功制得了PDP-BCN。Urea-PAGE能够根据蛋白质净荷质比区分β-CN和PDP-BCN。由于PDP-BCN经酶促反应去除部分磷酸基团，使其净电荷大大降低，而分子质量的变化可忽略不计，因此其荷质比明显降低，导致β-CN的电泳迁移率随脱磷酸程度的升高而降低。

采用CLSM观察β-CN和PDP-BCN在模拟婴幼儿胃液中消化0、30、60 min后的絮凝结构变化，结果如图4所示。在刚开始消化时，天然β-CN溶液与模拟婴幼儿胃液接触后形成了较大的絮凝结构，随消化时间的延长，凝块逐渐减小，但胃消化60 min时，仍有一部分较大的凝块存在；PDP-BCN溶液在刚与模拟婴幼儿胃液混合时，形成的絮凝结构相较于天然β-CN更小，随消化时间的延长，凝块越来越小，在胃消化60 min时几乎无较大的凝块存在，表明在模拟婴幼儿胃液中PDP-BCN比β-CN更易消化。PDP-BCN是β-CN脱除部分磷酸基团的结果，因此其等电点会高于天然β-CN，使其在模拟婴幼儿胃液（pH 4.0）中携带的正电荷大于天然β-CN，蛋白分子间的静电斥力更大，更不容易相互聚集，因而形成的絮凝结构更小。

如图5、表1所示，随消化时间的延长，β-CN和PDP-BCN的粒径分布均向小粒径方向迁移，同时2 组蛋白的平均粒径也随之减小，在消化起始及消化30、60 min后，β-CN和PDP-BCN的平均粒径分别为88.90、48.02、35.06 μm和23.42、19.80、18.82 μm，表明β-CN和PDP-BCN凝块逐渐被消化成更小的颗粒。与β-CN相比，在每个消 化时间点的PDP-BCN平均粒径均显著降低（P＜0.05），表明PDP-BCN比β-CN在SGF中形成的絮凝结构更小且消化得更快，与上述CLSM的观察结果相印证，也与Liu Dasong和Yang Tingting等的报道一致。

采用LC-MS/MS技术对β-CN和PDP-BCN在模拟婴幼儿胃肠消化过程中降解产生的肽进行鉴定，发现β-CN和PDP-BCN在消化结束后降解产生952 个肽段，对整体肽段的组成和特征进行分类分析：通过主成分分析（PCA）对样品间肽段的差异进行降维可视化；采用Venn图和柱状图对样品间肽段种类和丰度的差异进行表征；基于Peptigram软件对β-CN和PDP-BCN降解肽进行肽指纹图谱分析；进一步将样品中鉴定到的所有肽段与MBPDB[中的活性肽进行比对，以揭示β-CN和PDP-BCN降解产生活性肽的差异。

PCA能将原始数据压缩成多个PC描述原始数据集的特征，PC1表示能描述数据最明显的特征，PC2表示除PC1之外所能描述数据最显著的特征。如图6所示，PC1和PC2对样品差异的方差贡献率分别为80.37%和18.47%，共计98.84%，可以代表绝大部分变量信息。每种蛋白的4 个平行样本对应得分点重叠或者距离极近，说明样品的重复性良好。β-CN的得分点集中在图的右下侧，PDP-BCN位于左上侧，2 种蛋白间的得分点相聚较远，表明它们的肽段组成之间存在显著差异。

Venn图能够将β-CN和PDP-BCN肽段种类的重合情况和差异数量直观地展示出来。如图7所示，β-CN和PDPBCN降解产生的肽段分别为533 种和880 种，其中在2 组样品中均检测到的肽段有461 种，仅在β-CN样品中检测到的特异性肽段有72 种，仅在PDP-BCN样品中检测到的特异性肽段有419 种。结果表明PDP-BCN在模拟婴幼儿胃肠消化过程中产生肽段的种类多于β-CN，可能是由于脱除部分磷酸基团后，PDP-BCN结构产生了一定的变化，使得蛋白中更多的酶切位点暴露，因此产生了更多的特异性肽段。

图8展示了β-CN及PDP-BCN经体外模拟婴幼儿胃肠消化后降解产生的不同长度肽段的差异。在≤10、11～20、21～30和＞30每个区间内，PDP-BCN降解产生的肽段分别为172、458、198 种和52 种，β-CN降解产生的肽段分别为135、286、77 种和35 种，PDP-BCN产生的肽段种类均明显多于β-CN，表明PDP-BCN降解更充分。PDP-BCN和β-CN丰度最高的肽段区间均为11～20 个肽段，表明这2 种蛋白降解产生的主要肽段长度均为11～20，这与李星及Liu Dasong等的研究结果一致。

肽指纹图谱是指蛋白降解产生的肽段序列与原蛋白的氨基酸序列进行匹配，进而将肽段的种类、裂解位点及丰度全局性地展示出来。图9展示了PDP-BCN和β-CN的肽指纹图谱，每个样品单独一行。无论是肽段的种类还是丰度，PDP-BCN均高于β-CN，特别是在蛋白N端位置，这种差异尤为显著。这是因为β-CN的5 个磷酸基团均位于N端区域，对蛋白进行脱磷酸处理后，该位置的结构变化最大，空间位阻和静电斥力明显降低，使得此区域更多的酶切位点暴露，因此有机会产生更多的肽段。

肽比对图能够对蛋白降解产生的肽段序列进一步详细表征，可以将肽段的序列、裂解位点及丰度信息直观详细地展示出来。每个肽段序列都由绿色的框线包围，放置在前体蛋白的对应位点。重叠及相邻的肽段垂直排列，以免不同肽段之间混淆不易区分。与肽指纹图谱相似，每个肽框的绿色深浅与该位置肽段的丰度呈正比，即颜色越深，表明该肽段的丰度越高。由图9可知，PDP-BCN和β-CN消化产生肽段的差异主要集中在N端前10～60 个氨基酸的位置，因此图10详细展示了在此区域上述2 种蛋白产生的肽段差异情况。PDP-BCN产生的肽段数量远高于β-CN，此外，PDP-BCN具有6 个深绿色肽段即高强度肽段，而β-CN没有高强度肽段，表明在丰度上PDP-BCN也远大于β-CN。上述结果提示相对于β-CN，PDP-BCN在消化之后产生活性肽的潜力更高。

将β-CN和PDP-BCN样品中鉴定出的所有差异肽段与MBPDB中的活性肽进行比对，以分析2 种样品降解产生活性肽的差异，结果如表2所示。仅在PDPBCN样品中存在、未在β-CN样品中检测到的活性肽有8 种，涉及促进钙吸收、抗菌、抗炎、血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制、抗氧化以及抑制胆固醇溶解等活性。其中EAMAPK、LNVPGEIVE、RDMPIQAF和VLPVPQ这4 条肽段的强度最高，且研究表明EAMAPK对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度相对较低（≤25 μg/mL），提示其可能具有生理意义。LNVPGEIVE、RDMPIQAF和VLPVPQ发挥活性所需的半最大效应浓度相对较高，分别为290、209、100 μg/mL，提示其发挥生理作用需要较高的剂量。此外已有研究证实，EAMAPK可抵抗刷状缘肽酶水解并被Caco-2单层细胞吸收；富含LNVPGEIVE的酸奶可降低高血压大鼠的血压；VLPVPQ可被成年小鼠有效吸收并改善其脂质代谢紊乱。虽然上述活性肽已被证实可抵抗消化并进入细胞或体内发挥作用，但在复杂的消化产物混合物中，其实际功能可能受到其他组分的干扰，因此是否能在真实环境中发挥功能仍需后续实验验证。

以80%同源性检索数据库中的活性肽段（基于相似物理性质，选择特定的氨基酸被等同替代，如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；精氨酸和赖氨酸）。结果显示，β-CN和PDP-BCN样品的差异肽段中，仅在PDP-BCN样品中存在、未出现在β-CN样品中有活性肽潜力的肽段有137 种，其中有61 种具有潜在的促进钙吸收活性，有26 种具有潜在的抗菌活性，有10 种具有潜在的抗感染活性，有41 种具有潜在的ACE抑制活性；而仅在β-CN样品中存在、未出现在PDP-BCN样品中有活性肽潜力的肽段仅有31 种，其中没有促进钙吸收活性的潜力肽段，具有潜在的抗菌活性肽段10 种，具有潜在的抗感染活性肽段8 种，具有潜在的ACE抑制活性肽段22 种。结果表明，相比于β-CN，PDP-BCN样品在体外模拟消化过程中产生的活性肽种类更多，所涉及的活性范围更广，具有活性肽潜力的肽段更多。本研究聚焦于活性肽的鉴定和潜在活性肽的发掘，但未能直接验证其在实际婴幼儿胃肠环境中的稳定性、吸收性及复杂混合物背景下的生物活性。这些关键问题需通过后续实验，如体外模拟肠道吸收模型、类器官模型或动物实验进一步探讨。

本研究对牛乳β-CN进行酶法脱磷酸化修饰，制备PDP-BCN，并采用动态光散射、CLSM观察和LC-MS/MS技术对其体外模拟胃肠消化特性和肽谱进行表征。结果显示，PDP-BCN在模拟婴幼儿胃液中形成的絮凝结构及粒径显著小于天然β-CN，更易消化成小颗粒；而且其在模拟婴幼儿胃肠消化过程中降解产生肽段的种类和丰度均远高于天然β-CN，特别是在蛋白N端位置的差异尤为显著。此外，PDP-BCN产生活性肽的种类更多、涉及的活性范围更广，产生具有活性肽潜力的肽段更多。因此，在消化特性方面，PDP-BCN相较于天然β-CN具有明显优势，在未来有很大的潜力成为一种新型IMF蛋白配料。

作者简介

通信作者：

郭慧媛 教授

中国农业大学营养与健康系（校直属） 副主任

郭慧媛，女，教授，博士生导师。入选教育部重大人才工程特聘教授、北京市卓越青年科学家；获中国农学会青年科技奖、中国食品科学技术学会杰出青年奖。围绕精准营养与功能乳制品创制开展研究，担任教育部功能乳品重点实验室副主任、国家乳业技术创新中心营养健康科学家；主持国家重点研发计划项目1 项，国家自然科学基金项目4 项；在食品科学领域权威期刊发表多篇文章，获国家科技进步奖二等奖3 项，获得授权发明专利20  项。