《食品科学》:华南农业大学杨美艳副教授等:副溶血性弧菌烈性噬菌体vB_VpaP_FR4的分离表征、基因组分析及在食品中的应用

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的水生动物源人畜共患病原菌，可以黏附在水生动物的肠道并进行繁殖，引发鱼类和贝类等水产动物疾病，造成水产养殖的巨大经济损失。携带副溶血性弧菌的产品进入食品生产流通环节会造成加工环境的交叉污染或因烹饪方式不当直接引起人体食物中毒。

抗菌药物和化学保鲜是传统的食源性致病菌抑菌手段，但其涉及的细菌耐药性和食品安全问题愈发引起消费者的担忧。噬菌体是广泛存在于自然界的细菌病毒，能够特异性靶向并裂解宿主细胞，可作为一种新型抑菌手段。噬菌体已广泛应用在食品加工和贮藏等方面。作为常见的食源性致病菌之一，副溶血性弧菌对公共卫生安全造成较大威胁，噬菌体防治技术有望改善这一现状。

华南农业大学食品学院的朱斌、杨美艳*，广东环凯生物科技有限公司的吴毓薇*等人对从弧菌病爆发的鱼塘水样中分离所得的一株裂解性副溶血性弧菌噬菌体的遗传信息、生物学特性进行分析，并将其应用于三文鱼片中副溶血性弧菌的控制，进一步评价噬菌体处理对于食品感官性质，以期为开发噬菌体制剂及应用提供新思路。

以副溶血性弧菌Vp464为宿主分离噬菌体，成功纯化获得一株烈性噬菌体，命名为vB_VpaP_FR4（以下简称FR4）。FR4在含0.3%琼脂的TSB培养基上可形成直径约为1.2～2 mm的圆形清晰噬菌斑（图1A）。对纯化后的噬菌体进行透射电镜观察，噬菌体呈短尾噬菌体形态，头部为二十面体立体结构，直径约64 nm，短而非收缩的尾巴长约8 nm（图1B）。

噬菌体FR4是一种双链DNA病毒，基因组大小为42 784 bp，GC平均相对含量为49.27%（图2）。FR4共预测到48 个开放性阅读框，其中的24 个与编码已知功能蛋白的基因相匹配，分别可归为裂解模块、包装模块、DNA代谢模块、结构模块和DNA注射模块5 个功能域（表2）。与VFDB和CARD数据库进行比对发现，FR4不含毒力基因和抗生素基因。由于噬菌体能通过水平基因转移获得细菌携带的毒力基因和抗生素抗性，因此在噬菌体的实际应用中要求其不含这些基因元件。

噬菌体FR4的宿主谱如表3所示，其裂解谱覆盖了包括10 种血清型（O7、O9除外的O1～O12型）在内的64 株副溶血性弧菌（供试菌株共102 株），裂解率为62.7%。并且FR4对其中携带单个或多个耐药基因的18 株副溶血性弧菌具有良好的裂解能力，表明其具有良好的应用前景。

噬菌体FR4在不同MOI（0.001、0.01、0.1、1、10、100和1 000）下的效价见图5A。噬菌体FR4在MOI＝0.01时，产生的子代噬菌体数量最高，达到10.65（lg（PFU/mL）），但MOI＝0.01与0.001、0.1、1、10和100时产生的子代噬菌体数量不存在显著性差异。因此，FR4的最佳MOI范围为0.001～100。

一步生长曲线能够反映噬菌体的裂解周期。如图5B所示，静置吸附后，噬菌体FR4前5 min效价开始缓慢上升，表明FR4的潜伏期较短，约为5 min。此后，噬菌体效价急剧上升，直至35 min后趋于稳定，表明噬菌体FR4的裂解期约为30 min，35 min后进入平稳期。根据公式计算，噬菌体FR4的裂解量为26 PFU/cell。噬菌体FR4具有短潜伏期、繁殖速度快的特点，能在短时间内快速裂解宿主菌，更好地抵抗副溶血性弧菌的污染。

测定噬菌体对温度、pH值以及紫外光的耐受程度，能评估噬菌体在各种场景的应用潜力。如图6A所示，噬菌体FR4在4、20、30、40 ℃和50 ℃水浴1 h效价保持稳定，活性在此温度范围内不受影响。温度升高至60 ℃时，噬菌体相较初始效价下降约2（lg（PFU/mL））；当温度进一步上升至70 ℃时，效价降低了约3（lg（PFU/mL））；当80 ℃处理1 h后，噬菌体FR4效价仅为1（lg（PFU/mL））。以上结果表明，噬菌体FR4在相对低温的环境中能保持稳定，当温度高于60 ℃时会对噬菌体活性造成较大的影响。

噬菌体对pH值耐受情况如图6B所示，在pH 5～10时，效价无显著性变化，噬菌体保持良好的活性。当pH值为4和11时，噬菌体效价分别降低了约2.5（lg（PFU/ mL））和1.4（lg（PFU/ mL））。在pH≤3和pH≥12的强酸强碱环境中，噬菌体的生理功能遭到破坏，完全丧失活性。以上结果表明噬菌体FR4能够适应较大范围pH值的酸碱性环境。

如图6C所示，噬菌体FR4暴露在紫外线时，照射5 min后，效价降低约1.5（lg（PFU/ mL）），且紫外照射时间每增加5 min，噬菌体效价降低越明显，直至30 min时，噬菌体已完全失去活性。以上结果表明噬菌体FR4对紫外线敏感，因此在实际应用中，使用紫外线可轻松将噬菌体FR4失活，避免子代噬菌体污染等问题。

根据不同MOI加入相应效价的噬菌体和相应浓度的副溶血性弧菌，探究噬菌体FR4在TSB肉汤中对宿主菌Vp464的抑菌效果。如图7所示，未添加噬菌体的对照组中，宿主菌Vp464在经过约2 h的迟缓期后逐步进入对数期，并在8 h到达平稳期，12 h后进入衰亡期，细菌OD600出现轻微下降。实验组中，所有MOI的噬菌体处理组均在8 h内有效抑制细菌的生长。8 h后，不同MOI的噬菌体处理组展现不同的抑菌能力：MOI＝1 000和100组分别持续发挥抑菌作用至16 h和18 h，MOI＝10组效果次之，MOI＝1和0.1组效果紧随其后，MOI＝0.001组抑菌效果最差，但仍然可将细菌浓度控制在较低的水平，OD600低于对照组。以上结果表明，噬菌体的抑菌能力与其效价存在剂量-效应关系，高浓度的噬菌体的抑菌能力得到显著提升。因此，选取MOI＝10、100和1 000的组进行不同温度下三文鱼中副溶血性弧菌的抑菌研究。

根据2.6节实验结果，选取整体抑菌效果最好的3 个MOI（10、100和1 000）进行三文鱼抑菌实验。如图8A所示，在25 ℃条件下，样品中副溶血性弧菌残留数量随MOI的增高而下降，这一结果进一步验证了2.6节中的结论。实验组中，MOI＝10的噬菌体浓度在4 h后发挥抑菌作用，并在12 h内相较于对照组能一定程度抑制样品中副溶血性弧菌的数量；MOI＝100组的噬菌体在2 h后发挥抑菌作用，趋势基本与MOI＝10组相同；当MOI＝1 000时，噬菌体在24 h内对副溶血性弧菌有显著的抑制效果，且相较于对照组和其他实验组效果最好。以上结果表明，25 ℃条件下MOI为1 000时噬菌体抑菌作用最明显。

如图8B所示，在4 ℃的贮藏温度下，噬菌体对三文鱼中副溶血性弧菌的抑制效果远优于25 ℃噬菌体处理组。当MOI＝10时，噬菌体在2 h时开始抑制副溶血性弧菌的生长（约降低0.2（lg（CFU/mL））），并在120 h后完全抑制副溶血性弧菌的生长（低于检测限）。当MOI＝100和1 000时，相较于对照组，处理组刚加入噬菌体即表现出抑菌效果，2 h时副溶血性弧菌数量均下降了约1（lg（CFU/mL））。并且MOI＝100的噬菌体处理组在48 h后完全抑制细菌的生长，而MOI＝1 000的噬菌体处理组在72 h后完全抑制细菌的生长（低于检测限）。在MOI＝100和1 000的噬菌体处理组中，在4～12 h时，处理组中的副溶血性弧菌数量出现先回升后下降的现象，这可能是细菌为对抗高浓度噬菌体赋予的强选择压力产生抗性突变或是迫于选择压力细菌通过群体感应对抗噬菌体的侵染，但此时细菌未能完全避开噬菌体的捕食，因此细菌总体数量趋于下降。整体上看，在4 ℃条件下应用噬菌体对三文鱼中副溶血性弧菌的抑菌效果远优于25 ℃条件。原因在于4 ℃环境下副溶血性弧菌难以繁殖生长，总体数量呈现缓慢下降趋势，在此条件下叠加噬菌体裂解和低温抑菌双重作用，从而达到高效抑菌的效果。

感官评价作为最直接的评价食品品质的方法，能够直观体现消费者对食品的接受程度。通过添加/不添加噬菌体处理人工污染副溶血性弧菌的三文鱼样品，探究了噬菌体处理对三文鱼样品感官品质的影响。如图9A所示，在25 ℃处理条件下，空白对照组和阳性对照组感官得分基本一致，阴性对照组和噬菌体处理组感官得分基本一致。在8 h时，空白对照组和阳性对照组感官得分分别为6.4±0.548和7.0±0.707，此时色泽较前期变得暗淡，肉质光泽度和弹性逐渐开始下降，出现淡腥味。而阴性对照组和噬菌体处理组此时得分均为8.4±0.584，感官品质高于空白对照组和阳性对照组高一个档次；当处理12 h时，阳性组肉质呈现暗红色，无光泽，已基本无弹性，此时空白对照组和阳性对照组感官得分分别为5.2±0.447和5.8±0.447。而阴性对照组和噬菌体处理组感官得分分别为6.6±0.894和6.8±0.837，肉质品质为良，优于空白组和阳性组；当处理24 h后，空白组和阳性组感官品质被评为差，感官得分低于4 分，肉质出腐败，散发不愉快气味。而阴性对照组和噬菌体处理组感官得分均高于阳性对照组，表明噬菌体处理能有效抑制三文鱼腐败的速度。

如图9B所示，在4 ℃处理条件下，空白对照组和阳性对照组在8 h时，三文鱼品质分别评级为优（9.0±0.000）和良（7.4±0.584），此时色泽开始变暗淡，弹性逐渐下降，出现淡腥味。而此时阴性对照组和噬菌体处理组得分均为8.6±0.584，感官品质高于阳性对照组，为优；当处理48 h时，空白对照组和阳性对照组色泽呈现暗红色无光泽，已基本无弹性，感官得分分别为6.4±0.548和6.0±0.707，评级为次。而阴性对照组和噬菌体处理组感官品质仍为优，优于空白对照组；当处理72 h后，空白对照组感官品质评级为次，得分为5.6±0.548；阳性对照组感官品质被评为差，感官得分低于4 分，肉质出腐败，散发不愉快气味。而此时的阴性对照组和噬菌体处理组感官品质仍为良或次，得分始终维持在4 分以上，高于阳性组，表明低温下噬菌体处理有效抑制了三文鱼的腐败。

综上所述，噬菌体处理组均能够延缓三文鱼腐败变质的速度，4 ℃处理条件相较于25 ℃更优，且噬菌体处理这种方法本身并不影响三文鱼样品本身的感官性质和引起其他不愉快的变化。因此，使用噬菌体作为一种食品保鲜技术具有一定的应用前景。

传统的食源性致病菌防治主要依靠抗生素和化学保鲜剂等手段，由于病原微生物耐药性问题日趋严重，以及社会各界对食品安全日益重视，基于噬菌体抗菌活性的生物防治成为研究热点。噬菌体是天然的细菌病毒，依赖宿主细菌来合成和释放子代病毒粒子。数量庞大、高度的宿主特异性和不影响食品感官质量的特点使噬菌体成为一种新型生物抑菌剂。目前，世界范围内已有多种噬菌体制剂获批可使用于食源性致病菌的防治，如PLSV-1TM和PhageGuard Listex™等。

副溶血性弧菌作为引起腹泻的常见病原菌之一，对应的靶向噬菌体研究相对较少。国内外报道的副溶血性弧菌噬菌体主要呈现有尾形态，归为有尾噬菌体纲（Caudoviricetes）。FR4所在属的噬菌体在NCBI中共有全基因组38 条。副溶血性弧菌噬菌体的应用主要在两方面：副溶血性弧菌的生物被膜形成的控制和水产品中的抑菌研究。在控制生物被膜形成方面，本团队探究了噬菌体FE11对生物被膜形成的抑制和破坏作用·。在MOI＝0.1时，FE11能抑制副溶血性弧菌生物被膜的形成。并且当噬菌体浓度达到1×1010 PFU/mL时，能有效破坏已形成的生物被膜。黄振华重组表达了弧菌噬菌体裂解酶Lyz_V_pgrp、Lyz_V_pgp60和Lyz_V_zlis，这些噬菌体裂解酶对48 h预形成的副溶血性弧菌生物被膜的清除率超过90%，在48 h内对生物被膜形成的抑制率达80%以上。

在水产品抑菌方面，多数研究使用新发现的单一噬菌体进行抑菌研究，少数研究讨论了噬菌体鸡尾酒的应用效果。如Jun等使用噬菌体pVp-1处理牡蛎表面的副溶血性弧菌，在处理72 h后观察到细菌数量由对照组的8.9×106 CFU/mL减少到治疗组的1.4×10 CFU/mL。Tan等使用噬菌体Vp33、Vp22、Vp21和Vp02组成鸡尾酒A，使用噬菌体Vp08和Vp11组成鸡尾酒B，在鸡尾酒A和B处理24 h后，副溶血性弧菌数量分别下降3.69、4.81（lg（CFU/mL））。此外江艳华等探讨了噬菌体VpTYP2在不同贮藏温度下对三文鱼片中副溶血性弧菌的抑菌作用，结果表明，在4 ℃的共培养条件下，VpTYP2噬菌体对三文鱼片中副溶血性弧菌的抑菌效果显著优于对照组和15、25 ℃实验组，在共培养8 d后将副溶血性弧菌数量降至检测限以下。

本实验同样探究了噬菌体vB_VpaP_FR4在食品常见贮藏温度（4 ℃）和室温环境（25 ℃）下对三文鱼中副溶血性弧菌的抑菌效果，实验结果表明：在低温环境下，噬菌体对副溶血性弧菌的抑菌作用明显优于室温噬菌体处理组，不同MOI的噬菌体处理后能在72 h后完全抑制副溶血性弧菌的生长。这一结果在此前的研究中并未出现，也与多数研究结果不同。笔者认为，噬菌体在宿主细菌的最适生长温度区间内（25～37 ℃）保持较优的裂解活性，在低温环境时能维持活力但裂解能力下降。但低温环境下噬菌体应用效果优于常温这一现象在其他噬菌体中也有发现，如另外一株副溶血性弧菌噬菌体VpJYP2和单增李斯特菌噬菌体鸡尾酒在4 ℃条件下对不同食品基质中致病菌的抑菌效果更显著。这一结果可能是噬菌体的抑菌效果受环境温度调控，如增加自身复制、调控关键裂解基因的转录水平维持低温存活能力。另一方面，低温胁迫导致细菌本身生长受到抑制，而噬菌体在低温环境下能够保持效价稳定（图6A）并能继续发挥侵染作用裂解细菌。因此，噬菌体vB_VpaP_FR4在作为一种冷冻保鲜剂方面具有一定的应用前景。

噬菌体vB_VpaP_FR4具有相对较广的宿主谱，且能裂解多株耐药性副溶血性弧菌。以宿主菌Vp464为例，其自身对头孢氨苄、氨苄青霉素、链霉素、环丙沙星和卡那霉素等多种抗生素耐药，但噬菌体FR4在培养基和人工污染样品中对其展现出优良的抑菌性能（图7、8）。此外，在宿主谱测定过程中，将噬菌体进行稀释，在1×104 CFU/mL效价下，FR4仍能裂解部分耐药性副溶血性弧菌，表明其对其他耐药性副溶血性弧菌具有较好的抑菌效果。结合当下工程噬菌体领域的热点，将其尾蛋白替换或插入到其他噬菌体上，定制化获得宽/窄谱的工程噬菌体也是一个特定可行的思路。

但也要认识到，在噬菌体的实际应用层面消费者仍存在诸多疑虑，有无标准化法规执行是直接决定消费者可接受程度的关键因素。此外，实际应用过程中细菌迅速应对噬菌体的侵染产生的噬菌体抗性问题和不同复杂食品基质使得噬菌体在食品工业中的防治效果大打折扣。基于这些问题，如何明确噬菌体独特的药代动力学并打消消费者的顾虑，推动噬菌体在食品保鲜中的应用是未来重要的研究领域之一。其中，噬菌体衍生蛋白因其强大的抗菌活性和不引发细菌抗性的特点，已成为对抗病原体新工具。裂解酶作为噬菌体在感染后期表达产生的一种蛋白水解酶，通过破坏细菌细胞壁（主要是肽聚糖）的完整性达到裂解细菌的效果。相较于在食品中直接使噬菌体进行抑菌保鲜，消费者更接受添加酶类而非活的病毒。未来将对噬菌体vB_VpaP_FR4的裂解酶进行外源表达，通过外源添加裂解酶，进一步安全高效地降低食品中致病菌的污染水平。

本研究分离得到一株副溶血性弧菌烈性噬菌体vB_VpaP_FR4，并对其进行了生物学特性分析并应用于三文鱼片中副溶血性弧菌的抑菌研究。结果表明噬菌体FR4：1）基因组大小为42 784 bp，共预测到48 个开放性阅读框，其中的24 个编码已知功能蛋白，不含毒力基因和抗生素基因；2）呈短尾噬菌体形态，头部为二十面体立体结构，直径约64 nm，短而非收缩的尾巴长约8 nm，属于Autographiviridae科Maculvirus属；3）能裂解62.7%的受试菌株，MOI为0.001～100时，潜伏期为5 min，裂解期约为30 min，裂解量约为26 PFU/cell；4）在4～50 ℃和pH 5～10时维持稳定；5）能显著降低三文鱼中副溶血性弧菌的数量，值得注意的是，在低温的协同作用下，噬菌体能够完全抑制副溶血性弧菌的生长。以上结果表明，噬菌体FR4具备较优的应用潜力。

引文格式：

朱斌, 伍君权, 陈玲, 等. 副溶血性弧菌烈性噬菌体vB_VpaP_FR4的分离表征、基因组分析及在食品中的应用[J]. 食品科学, 2025, 46(21): 115-125. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250520-132. 

ZHU Bin, WU Junquan, CHEN Ling, et al. Isolation, characterization, genomic analysis, and food application of virulent bacteriophage vB_VpaP_FR4 infecting Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Science, 2025, 46(21): 115-125. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250520-132. 

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